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文檔簡介
1、本研究以杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)7月雌株嫩葉與新生幼枝為材料,根據(jù)杜仲轉錄組庫的片段注釋信息,采用5’-末端轉錄轉換cDNA末端快速擴增技術(Switching Mechanism At5’-end of the RNA Transcript Rapid Amplification of cDNA Ends,SMART RACE)從杜仲中成功克隆了編碼杜仲橡膠延長因子(rubber elongation f
2、actor,REF)的全長cDNA序列,該序列命名為EuREF1。分別構建了EuREF1基因的原核表達系統(tǒng)(pGEX-GST-EuREF1)和植物表達系統(tǒng)(pSH-35S-EuREF1),研究了EuREF1基因的表達情況。本研究獲得的結果如下:
1、EuREF1的cDNA序列全長1075bp,開放閱讀框678bp,編碼225個氨基酸。生物信息學分析顯示:EuREF1蛋白分子量約為24.9768 kDa,理論等電點pI為6.32
3、;氨基酸組成中以丙氨酸(11.1%)、纈氨酸(11.1%)、亮氨酸(8.4%)含量為最高,蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為30.63,屬于穩(wěn)定蛋白質。預測EuREF1蛋白二級結構中α-螺旋占66.67%,β-折疊占4.89%,螺環(huán)結構占28.44%,未發(fā)現(xiàn)信號肽,發(fā)現(xiàn)跨膜結構。NCBI進行EuREF1核酸序列blastn比對,結果顯示同源性最高的是鷹嘴豆(76%,Cicer arietinum XM_004502239.1)和梅花(69%,Prunus
4、 mume XM_008223935.1)的REF核酸序列;NCBI進行EuREF1氨基酸序列blastp比對,結果顯示同源性最高的是葡萄(42%,Vitis vinifera XP_002278036.1)和蓖麻(41%,Ricinus communis XP_002514917.1)的REF蛋白序列。保守結構域分析認為EuREF1具有與橡膠延長因子一致的區(qū)域。分析NCBI中已報道的所有REF蛋白序列,選取已報道的每個種屬中具有代表性
5、的、氨基酸序列完整的一個序列作為數(shù)據(jù)源,以此構建系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示杜仲EuREF1在進化歷程上與絕大多數(shù)植物的REF親緣性較遠,與之最近的為三葉橡膠REF。
2、在初始載體pGEX-6p-1的基礎上,構建了EuREF1基因的原核表達系統(tǒng)(pGEX-GST-EuREF1)并轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)。使用1mmol·L-1 IPTG誘導目的蛋白表達,進行SDS-PAGE檢測,產(chǎn)生了約為45kDa的蛋白,與預測的GST
6、::EuREF1融合蛋白相對分子量大小相近。說明EuREF1蛋白能在大腸桿菌中誘導表達,含有pGEX-GST-EuREF1的大腸桿菌表達菌株BL21可用于生產(chǎn)EuREF1蛋白。
3、在初始載體pSH737的基礎上,構建了EuREF1基因的雙子葉植物表達系統(tǒng)(pSH-35S-EuREF1),并使用農(nóng)桿菌介導法遺傳轉化普通煙草(Nicotiana. tabacum L.)品種長脖黃,對獲得的抗性植株進行GUS組織化學染色和基因組P
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