桑樹氮代謝相關(guān)基因的克隆及表達分析.pdf

1、氮素是植物生長、發(fā)育的必要元素，是植物的生命元素。植物可吸收利用的主要氮源是銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。為適應(yīng)外界不同氮素，植物進化出銨轉(zhuǎn)運蛋白和硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白對不同氮素進行分類吸收轉(zhuǎn)運和氮代謝。我國蠶桑業(yè)的歷史悠久。為了提高桑樹的產(chǎn)量，桑樹需要合理施用氮肥。但是，過量氮肥的施用，不僅不能被桑樹吸收而造成浪費，還會引起環(huán)境污染。從分子生物學(xué)角度研究桑樹氮代謝，為選育高效氮吸收的桑樹新品種提供理論依據(jù)，有利于提高桑樹對氮素的吸收效率，對桑樹遺傳育種工

2、作具有一定的理論意義。
　　本實驗以魯桑育71-1苗為材料，根據(jù)各物種的同源性分析比對后設(shè)計特異性引物，結(jié)合 RT-PCR、RACE、軟件拼接等技術(shù)獲得這三個基因的包含完整開放閱讀框的cDNA序列，并對其序列進行一系列生物信息學(xué)分析。運用不同氮素誘導(dǎo)處理與熒光定量PCR對克隆出的三個基因進行表達分析。
　　主要研究內(nèi)容如下：
　　1.桑樹高親和銨轉(zhuǎn)運蛋白AMT1基因的克隆、序列分析及表達分析
　　從魯桑育71-1

3、品種克隆得到包含完整開放閱讀框的MmAMT1基因，其序列長度即為1518bp，編碼505個氨基酸殘基，屬于銨轉(zhuǎn)運蛋白家族(Ammonium Transporter Family)。經(jīng)過生物信息學(xué)分析其與不同植物物種的同源性。在不同氮素條件，real-time PCR結(jié)果顯示：在不同濃度KNO3處理條件下，MmAMT1基因在低濃度、中濃度NO3-處理條件下的表達量均波動增加，而在高濃度NO3-處理條件下，MmAMT1基因的表達量波動減少了

4、；在不同濃度(NH4)2SO4處理條件下，MmAMT1基因在低濃度 NH4+條件下表達量提高，在中濃度和高濃度 NH4+條件下，表達量降低；保持總氮量一定，不同氮源誘導(dǎo)下，MmAMT1基因僅在NH4NO3的處理條件下表達量降低。
　　2.桑樹低親和銨轉(zhuǎn)運蛋白AMT2基因克隆、序列分析及表達分析
　　從魯桑育71-1品種克隆得到MmAMT2基因（國家專利申請?zhí)枺?01610203308.5），獲得完整的開放閱讀框序列，其序列長

5、度為1470bp，編碼489個氨基酸殘基，屬于Ammonium Transporter Family。經(jīng)過生物信息學(xué)分析其與不同植物物種的同源性。在不同氮素條件，real-time PCR結(jié)果顯示MmAMT2基因都會有不同程度的響應(yīng)以及表達量的變化。在不同濃度KNO3處理條件下，MmAMT2基因表達量變化的總體趨勢是先增加，直到最大值，然后下降，且在低濃度NO3-處理條件下的響應(yīng)度低于在中濃度和高濃度NO3-處理條件下的響應(yīng)度；在不同濃

6、度(NH4)2SO4處理條件下，MmAMT2基因在低濃度 NH4+條件下表達量提高，在中、高濃度 NH4+條件下表達量呈波動降低；保持總氮量一定，不同氮源誘導(dǎo)下，MmAMT2基因的表達僅在KNO3處理條件下升高。
　　3.桑樹硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1基因的克隆、序列分析及表達分析
　　從魯桑育71-1品種克隆得到MmNRT1基因（國家專利申請?zhí)枺?01610203634.6），其序列長度為1062bp，獲得一個819bp的開放

7、閱讀框序列，編碼272個氨基酸殘基，屬于MFS super family。經(jīng)過生物信息學(xué)分析其與不同植物物種的同源性。在不同氮素條件，real-time PCR結(jié)果顯示：在不同濃度KNO3處理條件下，MmNRT1基因表達量變化的趨勢均是先增加，然后下降。其響應(yīng)度在低濃度 NO3-處理條件下低于在中、高濃度 NO3-處理條件下；在不同濃度(NH4)2SO4處理條件下，MmNRT1在低濃度NH4+條件下表達量先升高后降低，變化不大。在中、高