丹參赤霉素合成與代謝相關(guān)基因家族的鑒定、分子克隆及表達(dá)分析.pdf

1、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所2012級博士研究生杜清丹參赤霉素合成與代謝相關(guān)基因家族的鑒定、分子克隆及表達(dá)分析學(xué)號：B2012009006博士學(xué)位論文學(xué)校代碼：10023學(xué)號：丹參赤霉素合成與代謝相關(guān)基因家族的鑒定、分子克隆及表達(dá)分析Identification，molecularcloningandexpressionanalysisofgenefamiliesinvolvedingibberellinmetabolisminSa／v

2、／amilotiorrhiza所院：姓名：學(xué)號：指導(dǎo)教師：導(dǎo)師小組：學(xué)科專業(yè)：研究方向：完成日期：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所杜清B2012009006盧善發(fā)研究員生藥學(xué)藥用植物分子生物學(xué)2015527中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所2012級博士研究生杜清丹參赤霉素合成與代謝相關(guān)基因家族的鑒定、分子克隆及表達(dá)分析學(xué)號：B2012009006摘要lUllIIIIIIIlUlUlIIIlllIIIIIIlllIIIII]111Y3075726

3、赤霉素為一種重要的植物生長激素，屬于四環(huán)二萜類化合物，是萜類化合物生物合成途徑的下游產(chǎn)物。赤霉素生物合成過程中，一般先通過質(zhì)體中MEP(2C甲基D赤蘚糖醇4磷酸)途徑合成中間產(chǎn)物GGPP(櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸)，再在一系列酶的催化下，形成不同種類的赤霉素。細(xì)胞質(zhì)和線粒體中合成GGPP的MVA(甲羥戊酸)途徑在赤霉素生物合成過程中也有一定作用。本論文從丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了內(nèi)根貝殼杉

4、烯氧化酶(SmKO)、貝殼杉烯酸氧化酶(SmKAO)、赤霉素20氧化酶(SmGA200x)、赤霉素3氧化酶(SmGA30x)和赤霉素2氧化酶(SmGA20x)等參與赤霉素合成與代謝相關(guān)的基因，基于PCR技術(shù)對鑒定得到的基因進(jìn)行了分子克隆，對cDNA和蛋白質(zhì)的序列特性以及亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究了它們在丹參根、莖、葉和花等多組織中的表達(dá)，分析了古巴焦磷酸合成酶(SmCPS)、內(nèi)根貝殼杉烯合成酶(SmKSL)、內(nèi)根貝殼杉

5、烯氧化酶(SmKO)、貝殼杉烯酸氧化酶(SmKA例、赤霉素20氧化酶(SmGA200x)、赤霉素3氧化酶(SmGA30x)和赤霉素2氧化酶(SmGA20x)等基因?qū)ν庠闯嗝顾谿A3處理的響應(yīng)情況。另外，對丹參赤霉素生物合成途徑上游基因IDI(刪_『徊∞凹)進(jìn)行了克隆及轉(zhuǎn)基因的初步分析。結(jié)果如下：(1)基于丹參全基因組序列，通過同源比對，鑒定了1個(gè)SmKO、2個(gè)SmKAO、6個(gè)SmGA200x、2個(gè)SmGA30x和11個(gè)SmGA20x基因

6、；采用PCR技術(shù)塒所有鑒定出來的新基因進(jìn)行了克隆，獲得全部22個(gè)基因的開放讀碼框序列(ORF)。(2)基于生物信息學(xué)分析了cDNA和推斷的氨基酸序列的特征，結(jié)果表明22個(gè)基因的ORF長度在9331557bp之間，理論等電點(diǎn)在538943之間，推測的蛋白質(zhì)長度在311和519氨基酸殘基之間，偏酸、堿性氨基酸都有，分子暈為34365773KDa?；赥argetP預(yù)測了22個(gè)蛋白質(zhì)的Ⅱ細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)SmKO、SmKA01和SmKA02氨基酸

7、序列的氮端含有分泌途徑的信號肽，口JI能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；SmGA200x4、SmGA20xl和SmGA20x5氨基酸序列的氮端含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可能定位jj：質(zhì)體；其它蛋白質(zhì)不含信號肽和轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可能定位。J二細(xì)胞質(zhì)。(3)分別構(gòu)建了植物KO、KAO、GA200x、GA30x和GA20x等蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)SmKO與胡麻科的芝麻(Sesamumindicum)和玄參科的黃色猴而花(Erythrantheguttata)親緣關(guān)系較近；Sm