TNF-a保守序列突變體的構(gòu)建及其對(duì)mTNF-a胞毒效應(yīng)的影響.pdf

1、腫瘤壞死因子（TNF-a）主要由活化的T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。它屬于腫瘤壞死因子超家族成員，該家族成員雖然生物學(xué)功能各不相同，但它們蛋白質(zhì)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列的46-58、119-130、150-157等區(qū)域高度同源（高度保守結(jié)構(gòu)域）；另外它們必須以同源三聚體形式與其相應(yīng)受體結(jié)合才能介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。因此，我們推測(cè)TNF超家族成員三聚體的形成可能和它們氨基酸序列中高度保守序列有關(guān)。本課題采

2、用重疊PCR方法將TNF-a保守序列中的第58位異亮氨酸突變?yōu)槔野彼幔↖58Y），第124位苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸（F124S），并將這2個(gè)TNF-a突變體分別亞克隆至pIREs-GFP-Xho1質(zhì)粒，然后，將2個(gè)突變體重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)TNF-a突變體對(duì)MCF-7細(xì)胞的胞毒效應(yīng)，為TNF-a分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的深入研究提供線索，對(duì)TNF-a的基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。主要研究結(jié)果如下：

3、
　　 ⑴pcDNA3.0-TNF-a突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建，克隆及鑒定。①重組體的構(gòu)建和克?。阂詐cDNA3.0-wtTNF-a質(zhì)粒為模板，用重疊PCR法定點(diǎn)突變58位（I58Y）、124位（F124S），用BamHI和XhoI對(duì)目的基因和 pcDNA3.0載體進(jìn)行雙酶切，并用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，通過(guò)其氨芐抗性挑選陽(yáng)性克隆。②陽(yáng)性克隆的鑒定：通過(guò)菌落PCR及上述限制性內(nèi)切酶雙酶切初步鑒定，篩選出陽(yáng)性克

4、隆，進(jìn)一步DNA測(cè)序分析，證實(shí)點(diǎn)突變獲得成功，僅在預(yù)計(jì)位點(diǎn)發(fā)生突變，其余核苷酸序列與野生型TNF-a序列相同。
　　 ⑵pIREs-GFP-Xho1-TNF-a突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建，克隆及鑒定。將熒光載體pIREs-GFP-Xho1質(zhì)粒用BglⅡ和XhoI進(jìn)行順序酶切，另外將上述2個(gè)突變體重組質(zhì)粒（I58Y、F124S）和pcDNA3.0-wtTNF-a，用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，取前者酶切的大片段和后者小片段用T4連接

5、酶連接，再轉(zhuǎn)化入DH5a，通過(guò)卡那抗性挑選陽(yáng)性克隆。以菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆。
　　 ⑶MTT法檢測(cè)野生型和各突變型TNF-a的細(xì)胞毒效應(yīng)。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染各突變型TNF-a和野生TNF-a的293T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以MCF-7為靶細(xì)胞，用MTT法比較其胞毒效應(yīng)。結(jié)果顯示I58Y、F124S的二個(gè)突變體的胞毒效應(yīng)分別為13%和23%，其胞毒效應(yīng)與野生型TNF-a相比明顯降低，分別降低67%和57%。
　　 研究表明：I58Y