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1、枇杷(Eriobotryajaponica Lindl.)是原產(chǎn)我國(guó)的亞熱帶冷敏水果,屬非躍變型果實(shí),根據(jù)果肉顏色可以分為白肉枇杷和紅肉枇杷兩大類。紅肉枇杷果實(shí)在采后冷藏過程中易發(fā)生果肉木質(zhì)化現(xiàn)象,表現(xiàn)為果肉硬度上升和木質(zhì)素積累,嚴(yán)重影響果實(shí)商品性。本論文研究了EjAP2-1、EjHSF3及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體參與枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制,為枇杷采后貯藏及木質(zhì)化調(diào)控提供了理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:
1.篩選獲得枇杷冷害木質(zhì)
2、化相關(guān)的AP2/ERF基因家族成員。利用枇杷RNA-Seq數(shù)據(jù)庫,克隆得到18個(gè)AP2/ERF基因,其基因表達(dá)對(duì)低溫響應(yīng)各異,其中EjERF8和EjERF16(激活型AP2/ERF)的表達(dá)受程序性降溫(LTC)處理抑制,與果肉木質(zhì)化呈正相關(guān)關(guān)系;EjERF7和EjAP2-1(抑制型AP2/ERF)的表達(dá)受LTC處理誘導(dǎo),與果肉木質(zhì)化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步利用雙熒光素酶體系,明確僅EjAP2-1可轉(zhuǎn)錄抑制木質(zhì)素合成結(jié)構(gòu)基因Ej4CL1啟動(dòng)子
3、活性,表明EjAP2-1可能負(fù)調(diào)控枇杷冷害木質(zhì)化。
2.解析了EjAP2-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控枇杷果實(shí)木質(zhì)化的生物學(xué)機(jī)制。酵母雙雜(Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EjAP2-1和EjMYB1/2存在蛋白互作,且雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EjAP2-1與EjMYB1/2存在協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng),即EjAP2-1抑制EjMYB1對(duì)木質(zhì)素合成的激活效應(yīng),并可增強(qiáng)EjMYB2的抑制效應(yīng)。進(jìn)一步利用基因定點(diǎn)突變技術(shù),將EjAP2-1的2
4、個(gè)EAR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變(mEjAP2-1),結(jié)果表明,mEjAP2-1喪失與EjMYB1/2的轉(zhuǎn)錄協(xié)同效應(yīng),但EAR突變并不影響mEjAP2-1與EjMYB1/2的蛋白互作。因此,EjAP2-1參與枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化可能是通過與EjMYB1/2蛋白互作實(shí)現(xiàn),EAR是EjAP2-1抑制功效的源頭,而EjMYB1/2則行使抑制信號(hào)傳遞功能。
3.明確了EjHSF3協(xié)同EjAP2-1參與調(diào)控枇杷果實(shí)木質(zhì)化的生物學(xué)機(jī)制。利用枇杷RNA
5、-Seq數(shù)據(jù)庫,分離得到了8個(gè)熱激蛋白基因(EjHsp70-1/2、EjsHsp1/2/3/4/5/6)和3個(gè)熱響應(yīng)因子(EjHSF1、EjHSF2和EjHSF3)。研究結(jié)果表明,EjHsp與EjHSF1具有協(xié)同表達(dá)模式,并響應(yīng)熱激處理(HT),同時(shí)EjHSF1能轉(zhuǎn)錄調(diào)控EjHsp的啟動(dòng)子。推測(cè)HT處理通過激活EjHSF1,進(jìn)而轉(zhuǎn)錄調(diào)控EjHsp,誘導(dǎo)提高枇杷抗冷性,即EjHSF1-EjHsp-抗冷性通路。EjHSF3不響應(yīng)HT,但受L
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