日本沼蝦精子游離和遺傳滅活技術(shù)研究及頂體反應(yīng)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、日本沼蝦（Macrobrachium nipponensis），俗稱青蝦，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種。雌核發(fā)育是一種重要的遺傳學(xué)技術(shù)，在快速建立純系、性別決定機(jī)制研究等方面得到了廣泛的應(yīng)用。與此同時(shí)，雌核發(fā)育技術(shù)也是一種重要的性別控制育種技術(shù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)單性養(yǎng)殖具有重要的作用。雌核發(fā)育過程中，精子雖正常進(jìn)入并激活卵子，但其細(xì)胞核在染色體中很快消失，其遺傳物質(zhì)并不發(fā)揮作用，胚胎的發(fā)育僅受母體遺傳控制。
　　目前，已有較多關(guān)于魚類雌核發(fā)育的

2、研究。然而，由于甲殼類動(dòng)物的精子被精莢包裹，且青蝦等甲殼類動(dòng)物具有抱卵特性，導(dǎo)致甲殼類動(dòng)物的雌核發(fā)育研究至今未能取得突破。本文擬采用胰蛋白酶酶解青蝦精莢以獲得游離精子，采用X射線照射活體雄蝦滅活精子遺傳物質(zhì)，同時(shí)克隆精子頂體反應(yīng)相關(guān)的絲氨酸蛋白酶基因（MnSP），以促進(jìn)青蝦雌核發(fā)育技術(shù)的進(jìn)步和精子受精過程分子機(jī)制的探索。
　　1、酶解法制備青蝦游離精子
　　為了從青蝦精莢中獲得數(shù)量多且存活的游離青蝦精子，本試驗(yàn)首次采用胰蛋白

3、酶消化青蝦精莢的方法，獲得了游離的青蝦精子。通過觀察游離精子形態(tài)，并經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，以每克精莢所獲得形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整且不被染色的存活精子數(shù)為依據(jù)，探究胰蛋白酶處理的最佳條件。在pH7.1的條件下，設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn)。設(shè)置了不同酶濃度(0.2％、0.4%、0.6%、0.8%)、處理時(shí)間(5min、10 min、15 min、20 min)和處理溫度(30℃、35℃、40℃、45℃)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定酶處理最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明，

4、酶濃度對(duì)獲得游離精子影響最大，其次是處理溫度和處理時(shí)間。酶處理的最適條件為：酶濃度0.8%，處理時(shí)間10 min，處理溫度40℃。經(jīng)優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)，表明上述理論組合確為最佳組合。本研究通過酶解法獲得較多數(shù)量的存活游離精子，為進(jìn)一步研究青蝦精子提供了前提條件。
　　2、X射線滅活活體青蝦精子的初步研究
　　利用X射線對(duì)雄性青蝦進(jìn)行不同時(shí)間的照射處理，將處理后的雄蝦與剛完成生殖脫殼的雌蝦交配。待雌蝦產(chǎn)卵后，計(jì)數(shù)雌蝦抱卵天數(shù)，并在顯

5、微鏡下觀察卵的畸形情況，以檢測(cè)X射線對(duì)青蝦精子的滅活效果。X射線管照射強(qiáng)度為100kV，5mA，源距10cm，照射時(shí)間為0min、30min、60min、90min和120min。照射30min組，抱卵天數(shù)及卵的畸形率較0min組無變化，卵的畸形率為0，卵能正常發(fā)育至孵化出膜。隨著照射時(shí)間的增加，在30～90min之間，雌蝦抱卵天數(shù)逐漸減少，且所抱卵的畸形率呈上升趨勢(shì)。照射120min組，抱卵天數(shù)較90min組變化不大，卵的畸形率達(dá)10

6、0%。在本實(shí)驗(yàn)照射時(shí)間范圍內(nèi)，確定了滅活青蝦精子遺傳物質(zhì)的最佳照射時(shí)間為90～120min。采用彗星實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)經(jīng)X射線處理后的各實(shí)驗(yàn)組青蝦的精子，根據(jù)彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)X射線滅活青蝦精子遺傳物質(zhì)的機(jī)理為使得青蝦精子染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的變性作用。
　　3、青蝦絲氨酸蛋白酶基因（MnSP）的克隆與表達(dá)分析
　　絲氨酸蛋白酶是一種參與精子頂體反應(yīng)的酶，在精子穿透卵膜過程中發(fā)揮重要的作用。本研究利用 cDNA末端快速克隆方法獲得

7、了日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的絲氨酸蛋白酶基因MnSP（GenBank登錄號(hào)為KP091755）全長(zhǎng)cDNA序列。該基因cDNA全長(zhǎng)1792bp，包含132bp的5′末端非翻譯區(qū)，1071bp的開放閱讀框(ORF)和589bp的3′末端非翻譯區(qū)。開放閱讀框編碼357個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為39.51KD。氨基酸序列比對(duì)分析顯示MnSP與其他物種絲氨酸蛋白酶基因的相似度為31%—42%。
　　不同組織熒

8、光定量 PCR檢測(cè)顯示：MnSP基因在雌雄蝦的鰓組織里面的表達(dá)量均最高；MnSP基因在肝胰腺里面也有表達(dá)，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在鰓組織中的表達(dá)，其他組織中的表達(dá)水平也均顯著低于鰓組織中的表達(dá)（P<0.05），這說明MnSP基因在青蝦中除了起到免疫功能外，可能也參與了青蝦的呼吸作用；此外，發(fā)現(xiàn)MnSP基因在雌雄蝦成體的肌肉組織中均沒有表達(dá)，說明該基因與成體青蝦的生長(zhǎng)無關(guān)；MnSP基因在精巢中沒有表達(dá)，在輸精管中的表達(dá)也極低，而在卵巢中表達(dá)顯著高于在

9、精巢和輸精管中的表達(dá)，并且在雌雄蝦的相同組織（鰓、肝胰腺、心臟）中的表達(dá)量相比較發(fā)現(xiàn)，雌蝦中的表達(dá)量均高于在雄蝦中的表達(dá)量，說明 MnSP基因在性腺中具有表達(dá)特異性，僅在雌性性腺中具有表達(dá)，且在其他組織中的表達(dá)也存在性別差異，推測(cè)MnSP基因是與性別差異相關(guān)的基因。
　　不同發(fā)育時(shí)期熒光定量 PCR檢測(cè)顯示：MnSP基因在胚胎發(fā)育各時(shí)期、出膜后幼體期、變態(tài)后發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，整體表現(xiàn)為在胚胎發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)量高于出膜后及變態(tài)后各發(fā)

10、育時(shí)期，表達(dá)變化趨勢(shì)由高表達(dá)變?yōu)榈捅磉_(dá)，在胚胎發(fā)育的囊胚期表達(dá)量顯著升高至頂峰，其后又降低，這可能是由于囊胚期細(xì)胞的分化最為旺盛，推測(cè)MnSP基因參與胚胎細(xì)胞的分化，并且當(dāng)蝦出膜后，MnSP基因參與幼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的作用明顯降低。
　　本文首次采用胰蛋白酶消化法成功獲得了數(shù)量多且存活率高的游離青蝦精子，得到了胰蛋白酶消化精莢的最佳處理?xiàng)l件，為青蝦精子的遺傳操作提供了方法上的支持；首次通過 X射線照射雄蝦實(shí)現(xiàn)了青蝦精子遺傳物質(zhì)的滅活，為