日本沼蝦蛻皮啟動(dòng)激素受體基因(ETHR)和生殖母細(xì)胞特有因子1(Gtsf1)基因的克隆及功能研究.pdf

1、青蝦，學(xué)名日本沼蝦（Macmbrachium nipponense），隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)，長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)，沼蝦屬(Macrobrachium)，主要分布在中國(guó)、日本、朝鮮半島和越南北部等國(guó)家的淡水水域。青蝦具有生長(zhǎng)快、繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要品種之一。近年來(lái)青蝦相關(guān)重要功能基因被廣泛研究，同時(shí)也是本實(shí)驗(yàn)

2、室的科研重點(diǎn)。目前本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)與生殖、生長(zhǎng)和性別相關(guān)的GIH、Vg、 VgR、IAG等近20個(gè)功能基因進(jìn)行了系統(tǒng)的科學(xué)研究。已報(bào)道，蛻皮啟動(dòng)激素受體(Ecdysis triggeringhormone receptor，ETHR)在昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中發(fā)揮重要作用，生殖母細(xì)胞特有因子1(Gametocyte-specific factor1，Gtsf1)在調(diào)控昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)育中具有重要功能，但在青蝦中未見(jiàn)上述2個(gè)基因相關(guān)研究的報(bào)道。

3、本文從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精卵巢表達(dá)譜中篩選得到ETHR和Gtsf1的同源EST序列，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行cDNA克隆、成體組織和發(fā)育過(guò)程表達(dá)模式分析以及RNA干擾研究，以闡明ETHR和Gtsf1在青蝦中承擔(dān)的功能，藉此推動(dòng)青蝦蛻皮和生殖細(xì)胞發(fā)育機(jī)制的研究。
　　ETHR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，它在昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理作用，但在甲殼動(dòng)物中未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。采用RACE技術(shù)克隆獲得青蝦ETHR基因cDNA序列長(zhǎng)1349 bp（Gen

4、Bank登錄號(hào):KU532132），開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)為1173 bp，編碼390個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)青蝦ETHR蛋白包含七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和在節(jié)肢動(dòng)物中高度保守的特定功能位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明青蝦ETHR蛋白與甲殼綱的大型水蚤(Daphniamagna)親緣關(guān)系最近。十個(gè)不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，在腦組織中表達(dá)最高，表明大腦是ETHR活動(dòng)的重要功能

5、場(chǎng)所。胚胎不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)結(jié)果顯示，ETHR基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)水平較低（卵裂、囊胚、原腸胚期），在無(wú)節(jié)幼體期逐漸增加，到蚤狀幼體階段ETHR基因的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)，出膜后表達(dá)量急劇升高(P＜0.05)。蛻皮周期表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦組織和表皮中均發(fā)現(xiàn)ETHR在蛻皮前期迅速上升(P＜0.05)，蛻皮后ETHR又恢復(fù)到較低水平，說(shuō)明ETHR與青蝦蛻皮密切相關(guān)。RNA干擾降低了ETHR的表達(dá)量，并使實(shí)驗(yàn)組青蝦蛻皮頻率降低，約為對(duì)

6、照組的一半，表明ETHR具有促進(jìn)青蝦蛻皮的作用。眼柄摘除能顯著提升ETHR mRNA的表達(dá)，同時(shí)蛻皮頻率在眼柄摘除后升高了30％，表明眼柄對(duì)ETHR基因表達(dá)和蛻皮具有抑制作用。
　　Gtsf1基因參與果蠅和小鼠的性腺發(fā)育調(diào)控，在維持生殖細(xì)胞正常生成中發(fā)揮著重要作用，但在甲殼動(dòng)物中未見(jiàn)研究報(bào)道。為了研究青蝦性早熟現(xiàn)象，本文采用RACE技術(shù)克隆獲得青蝦Gtsf1基因cDNA序列長(zhǎng)349 bp（GenBank登錄號(hào):KR349325），

7、開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)為240 bp，編碼79個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)青蝦Gtsf1蛋白包含1個(gè)zf-U11-48K結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明Gtsf1基因青蝦Gtsf1蛋白與昆蟲(chóng)綱的蝽類(lèi)(Lygushesperus)親緣關(guān)系最近。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，Gtsf1基因在性腺中表達(dá)很高，特別是在卵巢中表達(dá)最高（為精巢的6倍），其他組織中表達(dá)極低。卵巢不同發(fā)育時(shí)期

8、表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)育初期Gtsf1基因表達(dá)水平較低，隨著卵巢的發(fā)育，該基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)(P＜0.05)，在成熟期達(dá)到最高峰，在消退期顯著下降并恢復(fù)到較低水平(P＜0.05)。胚胎和胚后不同發(fā)育時(shí)期結(jié)果顯示，Gtsf1基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)水平較高，囊胚期時(shí)顯著升高并達(dá)到峰值(P＜0.05)，從原腸期顯著下降直至變態(tài)后第10天該基因表達(dá)水平維持較低水平(P＜0.05)。以上研究結(jié)果表明Gtsf1基因與生殖密切相關(guān)，特別是在卵巢