日本沼蝦促雄腺文庫構(gòu)建及性別相關(guān)功能基因研究.pdf

1、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)，俗名青蝦，是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦類，年產(chǎn)量超過25萬噸，年產(chǎn)值超過百億元。雄性日本沼蝦的生長(zhǎng)速度顯著快于雌性日本沼蝦，收獲時(shí)雄蝦規(guī)格為雌蝦的2-2.5倍，因此全雄化養(yǎng)殖具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。動(dòng)物性別的形成取決于兩個(gè)過程，即性別決定和性別分化，了解性別決定和性別分化機(jī)制是實(shí)現(xiàn)其性別調(diào)控和全雄制種的基礎(chǔ)。促雄腺(androgenicgland，AG)是甲殼類動(dòng)物特有

2、的內(nèi)分泌腺，在甲殼類動(dòng)物雄性分化及雄性特征維持方面具有重要的作用。目前，已見日本沼蝦等多種甲殼動(dòng)物促雄腺成體組織學(xué)研究的報(bào)道。關(guān)于促雄腺相關(guān)基因的研究主要集中在胰島素樣促雄腺激素基因(insulin-likeandrogenic gland hormone，IAG)。有關(guān)促雄腺發(fā)育過程組織學(xué)研究、促雄腺表達(dá)的性別相關(guān)基因的系統(tǒng)篩選及其表達(dá)規(guī)律等研究至今未見報(bào)道。
　　本研究擬以日本沼蝦為研究對(duì)象，對(duì)變態(tài)后發(fā)育過程進(jìn)行組織學(xué)觀察和類

3、固醇激素含量測(cè)定，以確定促雄腺及性腺分化的起始時(shí)間，發(fā)育過程及成熟時(shí)間;采用高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫和microRNA(miRNA)文庫，并在同源分析和表達(dá)量比較的基礎(chǔ)上篩選性別相關(guān)基因和性別相關(guān)miRNA;結(jié)合組織學(xué)切片數(shù)據(jù)、基因時(shí)空表達(dá)規(guī)律和RNA干擾結(jié)果，對(duì)篩選得到的性別相關(guān)基因進(jìn)行功能分析。
　　1.日本沼蝦變態(tài)后發(fā)育過程促雄腺及性腺發(fā)育組織學(xué)研究
　　在30℃的養(yǎng)殖條件下，以日本沼蝦全同胞家系為

4、材料，采用組織學(xué)切片及類固醇激素測(cè)定等方法對(duì)發(fā)育過程進(jìn)行研究。結(jié)果表明，促雄腺在變態(tài)后第10天(Post-larvae10，PL10)開始分化，出現(xiàn)索狀結(jié)構(gòu);隨后經(jīng)歷增殖期(PL10)、合成期(PL13)和分泌期(PL19)共3個(gè)發(fā)育階段;最后在PL19發(fā)育成熟，形成完整的促雄腺結(jié)構(gòu)。
　　日本沼蝦精巢和卵巢均在變態(tài)后第13天(PL13)開始發(fā)育。在PL13時(shí)，精原細(xì)胞開始形成，精原細(xì)胞呈不規(guī)則排列，而卵巢生殖上皮開始分化出呈橢圓

5、或多邊形的卵原細(xì)胞。精巢經(jīng)歷精原細(xì)胞期(PL13)、精母細(xì)胞期(PL16)、精細(xì)胞期(PL19)和精子期(PL22)共4個(gè)發(fā)育階段后，在PL22發(fā)育成熟，此時(shí)成熟的精巢生精小管內(nèi)充滿著成熟的精子;卵巢經(jīng)歷卵原細(xì)胞期(PL13)、初級(jí)卵母細(xì)胞期(PL16)、次級(jí)卵母細(xì)胞期(PL16)和卵子期(PL19)共4個(gè)發(fā)育時(shí)期后，在PL19發(fā)育成熟，此時(shí)卵巢充滿成熟的卵子。類固醇激素分泌量分析顯示，睪酮分泌量從PL1到PL22逐漸增加，然后維持在穩(wěn)

6、定水平至PL25，隨后逐漸下降;17β-雌二醇的分泌量從PL1到PL19逐漸增加，然后維持在穩(wěn)定水平至PL25，隨后逐漸下降。本研究顯示促雄腺與精巢發(fā)育過程均持續(xù)10天，但促雄腺早于精巢3天開始發(fā)育和成熟，為性別和生殖相關(guān)基因的篩選以及發(fā)育過程性別調(diào)控機(jī)制的研究提供參照。
　　2.日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建
　　采用Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫。提取日本沼蝦促雄腺總RNA用于構(gòu)

7、建促雄腺轉(zhuǎn)錄組，拼接后共產(chǎn)生78，408條轉(zhuǎn)錄本，核酸序列長(zhǎng)度從351 bp到23，271 bp;過濾后共獲得57，619個(gè)基因，平均核酸序列長(zhǎng)度為1，244.19bp。使用Blastp及Blastx在NCBI的non-redundant(Nr)及nucleotide sequence數(shù)據(jù)庫對(duì)拼接獲得的基因進(jìn)行功能注釋，促雄腺轉(zhuǎn)錄組共有70，702條轉(zhuǎn)錄本在Nr數(shù)據(jù)庫中找到了功能注釋，7，706條轉(zhuǎn)錄本沒有功能注釋。促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫中，

8、分別有33，203、13，817、17，868個(gè)基因與GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫中的基因序列高度同源。根據(jù)日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組中基因的功能注釋，共篩選到47個(gè)與其它物種性別決定和性別分化基因高度同源的基因或基因家族，包括IAG、sxl、Tra-2等。通過將促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫與日本沼蝦輸精管、精巢及卵巢轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析后，共篩選得到促雄腺高表達(dá)基因40個(gè)，為日本沼蝦性別相關(guān)的候選基因，其中24個(gè)基因?yàn)榇傩巯偬禺惐磉_(dá)，剩余的16個(gè)基因與I

9、AG基因具有相似的表達(dá)模式，其特點(diǎn)為在促雄腺中的表達(dá)量極高，但在輸精管、精巢和卵巢中的表達(dá)量極低。與此同時(shí)，日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組還篩選得到12，437個(gè)SSR標(biāo)記及65，535個(gè)SNP標(biāo)記。
　　3.日本沼蝦促雄腺microRNA文庫的構(gòu)建
　　采用Illumina Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建了日本沼蝦促雄腺miRNA文庫。去除掉低質(zhì)量的原始序列后，日本沼蝦促雄腺miRNA文庫測(cè)序共獲得22，549，954條高質(zhì)量的原始

10、序列;其中，長(zhǎng)度為18-32nt的序列共有17，574，958個(gè)，絕大部分(43.96％)原始序列長(zhǎng)度為20 nt到23nt。
　　通過在miRBase數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋，日本沼蝦促雄腺共得到1，077個(gè)miRNA，其中原始序列片段數(shù)超過60，000的miRNA包括miR-100，bantam，miR-184，miR-315，let-7，miR-315，miR-8-5p，miR-10，miR-8-3p和miR-12。使用NCBI

11、中的EST數(shù)據(jù)庫、SRA數(shù)據(jù)庫以及RNA-Seq構(gòu)建的日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組為背景參考進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別得到8，248，76，011和78，307個(gè)靶基因。根據(jù)靶基因的功能注釋，篩選得到48個(gè)與日本沼蝦性別相關(guān)的miRNA。
　　4.日本沼蝦性別相關(guān)基因的克隆、時(shí)空表達(dá)定量以及功能分析
　　根據(jù)基因的功能注釋，從日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組中挑選出與魚類及哺乳動(dòng)物Foxl2(Forkhead box L2)基因高度同源的序列進(jìn)行克隆、qR

12、T-PCR表達(dá)以及功能分析，以確定Fox12在日本沼蝦中的功能;根據(jù)基因在促雄腺中的表達(dá)量分析，從日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組中挑選出促雄腺極高表達(dá)基因Slow-tonic S2 tropomyosin(Sst)和Slow tropomyosin isoform(Sti)進(jìn)行克隆及qRT-PCR表達(dá)分析，以確定其是否為日本沼蝦性別相關(guān)基因。
　　4.1日本沼蝦Foxl2基因的克隆、表達(dá)分析及功能研究
　　采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)

13、(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)進(jìn)行克隆。日本沼蝦Fox12基因cDNA序列全長(zhǎng)為2，097 bp，包含1，740 bp的開放閱讀框，其編碼579個(gè)氨基酸序列(Accession no.KM821275)。日本沼蝦Foxl2基因與其他魚類和兩棲類動(dòng)物報(bào)道的Foxl2基因氨基酸序列一致性達(dá)到60％-75％，但其序列覆蓋度僅為20％;日本沼蝦Foxl2基因的氨基酸序列長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于其在魚類及兩棲

14、類動(dòng)物中的長(zhǎng)度;Foxl2基因包含一段高度保守的氨基酸序列，該序列位于日本沼蝦Foxl2基因245 aa到400 aa之間。日本沼蝦Foxl2基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物及魚類為一支，日本沼蝦為另一支。
　　不同成體組織qRT-PCR分析結(jié)果顯示，日本沼蝦Fox12基因在精巢和促雄腺中具有極高的表達(dá)量，而且在雄性心臟、腸、眼柄及鰓中的表達(dá)量顯著高于雌性中相同組織的表達(dá)量，推測(cè)日本沼蝦Foxl2基因參與雄性性別的分化發(fā)育。日本沼

15、蝦Fox12基因在不同發(fā)育時(shí)期定量分析結(jié)果表明，F(xiàn)oxl2基因在PL10出現(xiàn)表達(dá)高峰，與精巢開始分化時(shí)間基本吻合。上述結(jié)果表明Foxl2基因可能參與日本沼蝦雄性分化發(fā)育過程。采用RNAi技術(shù)對(duì)日本沼蝦Foxl2基因進(jìn)行功能分析，注射dsRNA后精巢及卵巢Foxl2基因的表達(dá)量顯著下降，但性腺發(fā)育指數(shù)(Gonad somatic index，GSI)未觀察到明顯變化，其它方面的影響有待進(jìn)一步研究。
　　4.2日本沼蝦Sst和Sti基

16、因的克隆及表達(dá)分析
　　采用RACE和qRT-PCR技術(shù)對(duì)日本沼蝦Sst和Sti基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析。日本沼蝦Sst和Sti基因的cDNA序列全長(zhǎng)分別為977 bp(Accession no.KF910722)和1，926 bp(Accession no.KF910723)，1到823bp序列完全一致，差異出現(xiàn)在824 bp以后的序列;Sst和Sti基因開放閱讀框均為852 bp，共編碼283個(gè)氨基酸序列，開放閱讀框的序列相似度

17、為95.82％，氨基酸序列差異主要在C端的269 aa到283 aa，其結(jié)果與美洲龍蝦報(bào)道的結(jié)果相似。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因與其它物種slow型原肌球蛋白進(jìn)化關(guān)系最近。
　　不同成體組織qRT-PCR定量分析結(jié)果顯示，Sst和Sti基因在促雄腺中的表達(dá)量最高，并顯著高于其在其它組織的表達(dá)量，表明其可能在日本沼蝦促雄腺中起重要作用。不同發(fā)育時(shí)期qRT-PCR定量分析結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因在溞狀幼體期和出膜后第10天(L10)表