單核苷酸多態(tài)性漏聲表面波基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、一、研究背景和目的 隨著“人類基因組計(jì)劃”的完成，揭開(kāi)了人類遺傳信息的秘密。許多遺傳疾病和癌癥都與基因序列中的突變密切相關(guān)，在這些突變中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymerphisms，SNP)是最豐富的遺傳變異，大約每100-300個(gè)堿基就有一個(gè)堿基可能發(fā)生突變，因此實(shí)現(xiàn)單堿基突變的早期、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的診斷，對(duì)于人類相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，對(duì)單堿基突變的檢測(cè)方法

2、報(bào)道很多。傳統(tǒng)的方法普遍存在操作繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力，影響因素較多，不能通用。盡管目前有了基因芯片、SNP檢測(cè)儀等新的儀器設(shè)備和技術(shù)，但價(jià)格昂貴，僅適用大型科研機(jī)構(gòu)。開(kāi)發(fā)一些簡(jiǎn)便、價(jià)廉、準(zhǔn)確且易于臨床推廣的方法是一件很有價(jià)值的工作。 壓電DNA生物傳感器具有操作簡(jiǎn)便，響應(yīng)迅速，靈敏度較高，價(jià)格低廉等特點(diǎn)，已經(jīng)成為進(jìn)行核酸的結(jié)構(gòu)分析和單堿基突變檢測(cè)的重要手段。漏聲表面波(LeakySurface Acoustic Wave，LSAW)傳感

3、器，是新發(fā)展起來(lái)的生物診斷技術(shù)，綜合了物理、材料、微電子、信號(hào)處理、工藝等眾多學(xué)科技術(shù)，利用壓電晶體的特殊切向激勵(lì)出LSAW，當(dāng)LSAW傳播路徑表面的質(zhì)量負(fù)載發(fā)生微小改變時(shí)，LSAW傳播的頻率和相位發(fā)生相應(yīng)的改變，從而對(duì)與傳感器表面生物敏感膜發(fā)生的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)的體波傳感器比較，LSAW傳感器具有高靈敏度、高精度、重復(fù)性及可靠性更好、功耗低、結(jié)構(gòu)工藝好等優(yōu)點(diǎn)，這使LSAW傳感器具有非常廣泛的應(yīng)用前景。 在本室前期工作

4、基礎(chǔ)上，本研究使用諧振型LSAW傳感器，結(jié)合DNA連接酶反應(yīng)和酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)建立了一種新的LSAW-SNP基因傳感器檢測(cè)方法，以乙型腦炎病毒E基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)為靶點(diǎn)，初步研究LSAW-SNP基因傳感器檢測(cè)方法在實(shí)際樣本檢測(cè)中的應(yīng)用情況。 二、方法 1.在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)雙端諧振型傳感器的結(jié)構(gòu)、相位記錄分析軟件、溫控系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，構(gòu)建了更適合于液相檢測(cè)的LSAW傳感器系統(tǒng)。用NI虛擬儀器信號(hào)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了

5、軟、硬件系統(tǒng)的改進(jìn)。設(shè)計(jì)了射頻標(biāo)簽式傳感器。 2.探討并優(yōu)化了DNA-LSAW基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行液相檢測(cè)時(shí)的各種影響因素，確定了雜交反應(yīng)的時(shí)間。 3.探討酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)用來(lái)放大LSAW基因傳感器檢測(cè)信號(hào)的可行性：分別用標(biāo)記生物素和未標(biāo)記生物素的探針固定于LSAW金膜的表面，然后加入標(biāo)記了HRP的鏈酶親和素進(jìn)行反應(yīng)，最后加入DAB/H2O2，檢測(cè)相位的變化。 4.利用酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)，結(jié)合Taq DNA連

6、接酶反應(yīng)，建立LSAW-SNP基因傳感器檢測(cè)體系：分別合成兩條寡核苷酸靶序列，兩者之間僅存在一個(gè)堿基差異(A/G)。5'端巰基化修飾的DNA探針Probe-1通過(guò)自組裝固定在金電極的表面，等位基因的可變堿基位于該探針3'末端，與target-G的可變形式對(duì)應(yīng)。加入靶序列和與靶序列中SNP位點(diǎn)下游片段完全互補(bǔ)的生物素標(biāo)記探針Probe-2，雜交后經(jīng)熱穩(wěn)定Taq DNA連接酶連接DNA切口，然后經(jīng)堿變性解雜交與靶序列完全互補(bǔ)的探針保留在傳感

7、器表面，再加入鏈霉親和素連接的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行反應(yīng)，最后加入DAB和H2O2，在金膜表面形成不溶性沉淀，導(dǎo)致LSAW基因傳感器相位增大，從而檢測(cè)到堿基變異位點(diǎn)的信息。 5.LSAW-SNP基因傳感器檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣本的檢測(cè)： 以乙型腦炎病毒E基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)(A2293G)為靶點(diǎn)，提取P3強(qiáng)毒株和SA14-14-2弱毒株的RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，純化ssDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序。用建立的LSAW-SNP基因傳

8、感器檢測(cè)方法對(duì)Inmol/L ssDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 三、結(jié)果 1.改進(jìn)后的雙端對(duì)諧振型LSAW傳感器穩(wěn)定性好，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析儀和NI信號(hào)采集系統(tǒng)檢測(cè)10分鐘內(nèi)氣相和液相均≤0.1°，達(dá)到實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的要求。對(duì)同一濃度的探針和靶序列雜交，分別在網(wǎng)絡(luò)分析儀和NI信號(hào)采集系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相位變化均為1.3°，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的要求。 2.雙端對(duì)諧振型LSAW傳感器液相雜交反應(yīng)的最適條件，最佳pH值為7.6，最佳離子濃度度為0

9、.3mol/L，最佳DNA探針固定濃度為0.5μmol/L，最佳靶序列濃度為1.0μmol/L。并確定雜交反應(yīng)最終時(shí)間為33min。 3.經(jīng)酶生物信號(hào)放大后，標(biāo)記生物素的探針相位變化顯著增大，相位增大了約16倍，而未標(biāo)記生物素的探針相位變化很小。 4.LSAW-SNP基因傳感器檢測(cè)結(jié)果，target-G能引起相位的顯著變化，21倍于target-A。信號(hào)放大后的檢測(cè)時(shí)間可縮至20min。對(duì)不同濃度的target-G進(jìn)行檢

10、測(cè)，最低檢出限為1×10-12mol/L。在1×10-12~1×10-6mol/L范圍內(nèi)target-G濃度的對(duì)數(shù)與傳感器的相位變化值成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△P=1.8531gC+22.235，相關(guān)系數(shù)r=0.976。 5.SA14-14-2靶序列相位變化顯著，P3靶序列相位變化很小，與基因測(cè)序結(jié)果一致。 四、結(jié)論 1.反射柵陣列的引入提高了有用信號(hào)的檢測(cè)，改進(jìn)后雙端對(duì)諧振型LSAW傳感器組成的檢測(cè)系統(tǒng)

11、可以滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和研究。 2.酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)可以顯著增加LSAW基因傳感器檢測(cè)DNA靶序列時(shí)的相位變化，有效提高了信噪比，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度，為生物傳感器檢測(cè)生物學(xué)反應(yīng)提供了可靠的信號(hào)放大方法，在生物傳感器領(lǐng)域有了極大的應(yīng)用潛力。 3.基于DNA連接酶和酶生物放大反應(yīng)的LSAW-SNP基因傳感器檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)對(duì)乙型腦炎病毒實(shí)際樣本SNP位點(diǎn)(A2293G)檢測(cè)，具有較高的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性。為臨床SNP檢測(cè)提供