砷對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及硒干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　 研究不同濃度砷對(duì)體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用;不同濃度硒對(duì)體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;適宜濃度的硒對(duì)不同濃度砷造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的拮抗作用。
　　 方法
　　 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)置于37℃,5％CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組:加砷組、加硒組和加砷

2、加硒組。加硒組硒(Se)濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、2μmol/L。加砷組和加砷加硒組砷(As)濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.5、3、6、12μmol/L,加砷加硒組硒濃度為0.1μmol/L,每組均設(shè)空白對(duì)照作為對(duì)照組。連續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液與細(xì)胞待用。采用四唑鹽(Methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活性;瑞氏-吉姆薩染色(Wrigh-Giemastaining)

3、觀(guān)測(cè)細(xì)胞形態(tài),吖啶橙熒光染色(Acridine orang staining)測(cè)定細(xì)胞凋亡的情況。檢測(cè)培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-px)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及誘

4、導(dǎo)型一氧化氮合酶(Induciblenitric oxide synthase,iNOS)活性。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular celladhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子-1(Vasular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)的表達(dá)情況。采用逆轉(zhuǎn)

5、錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription polymersade chain reaction,RT-PCR)測(cè)定eNOSmRNA、iNOSmRNA表達(dá)水平。多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果
　　 1砷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用
　　 1.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察
　　 瑞氏-吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)加砷組血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量隨著濃度的增大而減少,內(nèi)皮細(xì)胞收縮變形,細(xì)胞間隙增大,隨著濃度的

6、升高,細(xì)胞膜損傷,細(xì)胞核固縮。出現(xiàn)“裸核”現(xiàn)象,甚至可見(jiàn)網(wǎng)狀的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。吖啶橙染色細(xì)胞核變形明顯,聚集在細(xì)胞邊緣,熒光碎片增多。
　　 1.2砷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 加砷組與對(duì)照組相比,砷濃度為0.05μmol/L時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)正常(P＞0.05)。砷濃度為0.1μmol/L時(shí)明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)(P＜0.01),抑制作用隨著培養(yǎng)液中砷濃度的增大而增強(qiáng)。
　　 1.3砷對(duì)培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px活性和MDA含

7、量的影響
　　 砷濃度為0.05μmol/L時(shí),SOD、GSH-pX活性和MDA含量均無(wú)顯著變化(P＞0.05),砷濃度為0.5μmol/L時(shí),培養(yǎng)液中MDA含量明顯增加(P＜0.05)。隨著砷濃度的升高,SOD、GSH-pX活性下降,MDA含量增加(P＜0.01)。
　　 1.4砷對(duì)培養(yǎng)液中NOS活性及細(xì)胞NOSmRNA表達(dá)水平的影響
　　 砷濃度為0.05、0.1μmol/L時(shí),對(duì)NOS活性及NOS mRNA

8、表達(dá)無(wú)影響,(P＞0.05),隨著砷濃度增大eNOS活性及eNOS mRNA表達(dá)水平逐漸減弱(P＜0.01),iNOS活性和iNOSmRNA表達(dá)水平則逐漸增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 1.5砷對(duì)培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響
　　 砷濃度為0.05、0.1μmol/L時(shí),對(duì)培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)無(wú)影響(P＞0.05);隨著砷濃度的增大,兩種CAM表達(dá)水平逐漸增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2硒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　 通過(guò)研究硒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、培養(yǎng)液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、內(nèi)皮細(xì)胞NOS活性和NOSmRNA表達(dá)、內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響,0.1μmol/L硒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)任何不良影響且有一定的積極作用,從而確定硒的干預(yù)劑量為0.1μmol/L。
　　 3硒對(duì)砷造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用
　　 3.

10、1硒對(duì)砷造成細(xì)胞形態(tài)改變的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細(xì)胞48 h后細(xì)胞染色觀(guān)察,砷濃度0.05、0.1μmol/L細(xì)胞形態(tài)正常;隨著砷濃度的增加,細(xì)胞形態(tài)逐漸不規(guī)則,細(xì)胞膜損傷加重,凋亡細(xì)胞增多。吖啶橙染色可見(jiàn)形熒光碎片增多。
　　 3.2不同濃度砷和適量硒對(duì)細(xì)胞活性的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細(xì)胞48 h后,MTT測(cè)定細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,與同劑

11、量加砷組相比,在砷的濃度為0.1、0.5μmol/L時(shí),細(xì)胞增殖率升高,(P＜0.05)。隨著砷濃度的增大,與加砷組比較,各組細(xì)胞增殖率均有所升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)
　　 3.3不同濃度砷和適量硒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細(xì)胞48 h后,與同劑量加砷組相比,培養(yǎng)液中SOD在砷濃度為0.05、0.5μmol/L,GSH-

12、px在砷濃度為0.05、0.1μmol/L時(shí),活性均有所升高(P＜0.05)。培養(yǎng)液中MDA含量在砷濃度為0.05、0.1μmol/L時(shí)有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4不同濃度砷和適量硒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中NOS活性和細(xì)胞NOSmRNA表達(dá)的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細(xì)胞48 h后,與同劑量加砷組相比,砷濃度為0.05、0.1、0.5μmol/L時(shí),eNOS活性升高(

13、P＜0.05),砷濃度為0.05、0.1μmol/L時(shí),iNOS活性降低(P＜0.05)。RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示,砷濃度為0.05、0.5、1.5μmol/L時(shí),加砷加硒組eNOS mRNA含量升高(P＜0.05),砷濃度為0.05、0.1、1.5μmol/L,時(shí),加砷加硒組iNOS mRNA含量有所下降(P＜0.05)
　　 3.5不同濃度砷和適量硒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μ

14、mol/L硒培養(yǎng)細(xì)胞48 h后,與同劑量加砷組相比,砷濃度為0.05、0.1μmol/L時(shí),加砷加硒組細(xì)胞培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1含量降低(P＜0.05),隨著砷濃度增大,細(xì)胞培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1雖有不同程度降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、砷可以使內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,并且導(dǎo)致細(xì)胞的調(diào)亡;適量硒可拮抗砷對(duì)細(xì)胞的損傷。
　　 2、砷可使培養(yǎng)液中的SOD、GS

15、H-Px活性降低,MDA含量增高;適量硒可改善這種現(xiàn)象,使SOD、GSH-Px活性明顯升高,MDA含量下降。
　　 3、砷可抑制內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá),使培養(yǎng)液中eNOS活性降低;刺激iNOS mRNA的表達(dá),使培養(yǎng)液中iNOS活性增強(qiáng);適量硒可以改善砷對(duì)細(xì)胞NOS mRNA的影響,使eNOS和iNOS活性趨于正常。
　　 4、砷可刺激內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá),使培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)水平增高;