DDR2與MMP-13表達(dá)相關(guān)性在RA關(guān)節(jié)軟骨破壞中作用的初步研究.pdf

1、關(guān)節(jié)滑膜組織的過度增生和對(duì)軟骨的侵蝕是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)畸形的直接原因。我們前期的研究表明，盤狀結(jié)構(gòu)域受體激酶(Discoidin Domain Receptor 2，DDR2)在RA成纖維樣滑膜細(xì)胞中高表達(dá)，并且此受體可以被膠原活化從而增加滑膜細(xì)胞MMPs的表達(dá)水平。由于MMP-13被認(rèn)為是RA關(guān)節(jié)軟骨破壞過程的限速酶，我們提出了如下假設(shè)：“Ⅱ型膠原-DDR2-MMP-13”這樣一個(gè)環(huán)路可能是RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的關(guān)

2、鍵環(huán)節(jié)。為深入探討DDR2-MMP-13通路在RA關(guān)節(jié)軟骨破壞中的作用，我們分析了RA和OA滑膜組織中DDR2和MMP-13的表達(dá)水平及組織定位，并構(gòu)建了DDR2-MMP-13檢測(cè)系統(tǒng)，為深入探索此通路的關(guān)鍵信號(hào)分子奠定了基礎(chǔ)。 首先，我們利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)比分析了RA和OA病人滑膜組織中DDR2和MMP-13的表達(dá)水平及表達(dá)分布。結(jié)果顯示，MMP-13在RA和OA滑膜組織中均有表達(dá)，但RA中的表達(dá)水平明顯高于OA；DDR2

3、只在RA滑膜細(xì)胞中高表達(dá)。此外，進(jìn)一步分析兩種蛋白的表達(dá)分布，結(jié)果顯示DDR2和MMP-13在RA滑膜層的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于滑膜下層。為了深入探索DDR2-MMP-13通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，構(gòu)建受DDR2調(diào)控的MMP-13表達(dá)檢測(cè)系統(tǒng)成為迫切而重要的基礎(chǔ)性工作。檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建按如下方案進(jìn)行：1.DDR2表達(dá)及其突變體的構(gòu)建提取人RA滑膜細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。依據(jù)GenBank登錄的DDR2序列合成引物，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增D

4、NA，回收和純化PCR產(chǎn)物并將其插入到pMD 18-T載體中進(jìn)行克隆后測(cè)序分析，用BLAST程序驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。以擴(kuò)增成功的野生型DDR2序列為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)第471位和第608位氨基酸突變的引物，通過重疊延伸法PCR擴(kuò)增獲得Y471F和K608E突變序列。將測(cè)序正確的片段分別插入到pcDNA3.1(-)Amyc/his表達(dá)載體中，使表達(dá)片段與myc標(biāo)簽進(jìn)行融合，利于后續(xù)的檢測(cè)。2.DDR2相關(guān)表達(dá)載體活性的檢測(cè)為了證實(shí)所構(gòu)建的DDR2表

5、達(dá)載體能在細(xì)胞中正確表達(dá)并能被膠原活化，我們將構(gòu)建的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞16小時(shí)后，無血清饑餓過夜，然后以30 μg/mL的Ⅰ型膠原刺激2 h。免疫印跡(Western blotting)顯示，所有的表達(dá)載體都能正確表達(dá)；此外，野生型DDR2分子被膠原刺激后酪氨酸磷酸化水平明顯增加，而K608E突變體的磷酸化則受到完全抑制，Y471F突變體的磷酸化水平與野生型無明顯差別。3.DDR2相關(guān)表達(dá)載體對(duì)MMP-13啟動(dòng)子報(bào)告基因誘導(dǎo)活

6、性的檢測(cè)將DDR2相關(guān)表達(dá)載體與MMP13-PGL3熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光素酶活性分析顯示，野生型DDR2分子能使MMP-13啟動(dòng)子活性增加2.5倍；而K608E突變體則與pcDNA對(duì)照載體的活性無明顯差別；Y471F突變體對(duì)MMP-13啟動(dòng)子的誘導(dǎo)活性與野生型DDR2分子相似。說明DDR2能夠調(diào)控MMP-1 3的表達(dá)，且依賴于其激酶活性。4.靶向針對(duì)DDR2的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及活性檢測(cè)根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則