單增李斯特菌毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的克隆和誘餌蛋白載體的構(gòu)建.pdf

1、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種重要的人獸共患食源性致病菌,引起人和動物的敗血癥、孕婦流產(chǎn)、腦膜腦炎等。在LM感染過程中,多種毒力因子與宿主細(xì)胞相互作用,發(fā)揮其毒力,目前對于LM引發(fā)腦膜炎的作用機(jī)制并不清楚。鑒于此,本研究通過對LM的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ克隆、測序、構(gòu)建誘餌質(zhì)粒,并對誘餌質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)的檢測和自激活的檢測,為下一步酵母雙雜交提供誘餌蛋白,從而進(jìn)一步揭

2、示這些誘餌蛋白在LM侵染大腦過程中的作用機(jī)制,以期為闡明LM的致病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、LM毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ克隆及序列分析:為了研究單增李斯特菌新疆羊源臨床分離的4b血清型菌株(簡稱 LM90)毒力基因的變異情況。運(yùn)用PCR技術(shù)對LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增,亞克隆到pMD19-T載體中,篩選出陽性菌并進(jìn)

3、行序列的測定。將序列提交到 GenBank上(登錄號分別為 KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),測序后用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行分析。結(jié)果:LM90的毒力基因 Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ與 F2365參考株的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ核苷酸的同源性分別為98.04％、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同

4、源性分別為99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%?？梢妴卧隼钏固鼐陆蛟磁R床分離株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ序列相對穩(wěn)定。
　　2、誘餌載體的構(gòu)建及其功能的檢測:為了利用酵母雙雜交篩選與Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ毒力基因互作的宿主蛋白,構(gòu)建5種毒力基因的誘餌載體是其基礎(chǔ)。首先將經(jīng)過sfiⅠ酶切的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ毒力

5、基因的克隆載體和誘餌載體PDHB1、PBT3-N進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α,將重組誘餌質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切驗(yàn)證后,通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化至酵母NMY51中。其次對誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測:
　　(1)用兔源的LM90的多克隆抗體和羊抗兔的HRP標(biāo)記的二抗對酵母中的誘餌質(zhì)粒進(jìn)行 Western blot檢測。
　　(2)將陽性載體pOst1-NubI和陰性載體pPR3-N分別轉(zhuǎn)化至含有誘餌質(zhì)粒酵母菌中,通過酵母菌

6、在SD-Leu-His、SD-Leu-His-Trp和SD-Leu-His-Trp-Ade培養(yǎng)基中的顏色,判斷誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:通過 PCR和酶切鑒定,成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒并得到了陽性酵母菌。Western blot沒有檢測到誘餌蛋白,功能檢測的陽性組在三種培養(yǎng)基中均有白色或者粉色的酵母菌落出現(xiàn),而陰性組在 SD-Leu-His-Trp、SD-Leu-His-Trp-Ade培養(yǎng)基中有極少量或沒有酵母菌落長出,說明

7、誘餌載體的蛋白已成功表達(dá)。
　　3、抑制誘餌載體自激活3-AT濃度的篩選:為了抑制誘餌載體的自激活,降低酵母雙雜交的假陽性,有必要進(jìn)行 His抑制劑3-AT濃度的篩選。將構(gòu)建cDNA文庫的空質(zhì)粒pPR3-N通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到表達(dá)誘餌質(zhì)粒的酵母菌中,分別添加10M、15M、20M、25M、30M、35M、40M、45M濃度的3-AT,于SD-Leu-His-Trp-Ade培養(yǎng)基中,觀察酵母菌的生長情況。
　　結(jié)果:Ami-PD