LAMP和PCR檢測單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)簡稱單增李斯特，它是一種能夠引起人畜共患的食源性致病菌，屬李斯特菌屬。它在自然界中分布廣泛，如土壤、腐敗的蔬菜及多種食品中。食用了被單增李斯特污染的食物后可以引起“李氏桿菌病”，使人和動(dòng)物患腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，死亡率可達(dá)20％～30％。該菌主要侵襲孕婦、新生兒、老年人和免疫力低的人群。近年來由該菌引起的食物中毒事件越來越多，引起了人們的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測單增李

2、斯特的方法操作繁瑣、檢測時(shí)間較長，通常需要5～7d才能完成且靈敏度較低。不能滿足食品中致病菌快速、靈敏的檢測需要。因此需要建立快速、靈敏的單增李斯特的檢驗(yàn)方法。 目前，快速檢測單增李斯特的方法報(bào)道最多的是應(yīng)用PCR方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP)是2000年由日本的榮研株式會(huì)獨(dú)自開發(fā)出來的一種新的核酸擴(kuò)增方法。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特

3、異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(65℃左右)下進(jìn)行擴(kuò)增?？梢栽?h之內(nèi)，將靶DNA片段擴(kuò)增109～1010加倍。 本研究以單增李斯特的李氏溶血素基因(hly)為靶基因，選擇特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)成功設(shè)計(jì)了LAMP引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并與PCR進(jìn)行比較。 對(duì)PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度、退火溫度和循環(huán)數(shù)等PCR影響要素進(jìn)行優(yōu)化，以確定適宜PCR.反應(yīng)體系和PC

4、R擴(kuò)增程序。PCR反應(yīng)的總反應(yīng)體系為50μL,其中含有5μL10×PCR buffer，4μL dNTPs混合物，2μL 10μmol/L上游引物，2μL 10μmol/L下游引物，4μL氯化鎂，0.5μL，(5U/μL)Taq DNA聚合酶，32.5μL，ddH2O；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?PCR反應(yīng)采用冷啟動(dòng)，94℃預(yù)變性4 min，再按94℃變性45s～60℃退火30s～72℃延伸45s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5min。PCR反

5、應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，產(chǎn)生預(yù)期大小的片段(702bp)。 基于單增李斯特的hly基因利用官方設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出LAMP反應(yīng)的外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP。并對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度、內(nèi)外引物濃度比等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。LAMP反應(yīng)的總反應(yīng)體系為25μL，其中含有0.8μmol/L的FIP和BIP，0.2μmol/L的F3和B3，400μmol/L的每種dNTP，1mol/L的甜菜堿

6、，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，4 mM MgSO4，0.1％Triton-100和一定量的模版DNA。將反應(yīng)混合物在95℃加熱5min后放置冰上冷卻，然后加入8 U的Bst DNA聚合酶大片段，在63℃孵育60min，然后在80℃加熱10min終止反應(yīng)。LAAMP反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，產(chǎn)生預(yù)期的梯形條帶。對(duì)12株菌分別進(jìn)行了PCR反應(yīng)和LA

7、MP反應(yīng)來驗(yàn)證引物的特異性，結(jié)果表明:單增李斯特均為陽性結(jié)果，其它菌株均為陰性結(jié)果。采用FTA濾膜制備模板進(jìn)行PCR和LAMP反應(yīng)，其方法的靈敏度分別為1.4×102CUM/mL和7.3×10CFU/mL。利用PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)直接檢測人工污染的雞肉中的單增李斯特，檢出限分別為9.6×102CFU/g和8.9×10CFU/g。 通過兩種方法的比較，可知LAMP比PCR更快速、靈敏。有著更為廣泛的發(fā)展前景。通過本課題的研究，