黃孢原毛平革菌木質素過氧化物酶基因（lipC）轉錄調控因子的研究.pdf

1、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)屬于白腐擔子真菌，是研究木質素生物降解的模式生物，因其具有出色的降解木質素的能力，而且對環(huán)境中的有毒物質、爆炸污染物等也有降解作用，因此P.chrysosporium在造紙工業(yè)、環(huán)境保護等方面具有重要的應用前景。研究表明，P. chrysosporium降解木質素是由眾多的胞外過氧化物酶參與的復雜的生物過程，LiP和MnP是主要的2類過氧化物酶。Northernbl

2、ot和RT-PCR分析表明。這2類酶均受到C、N、O等因素的調節(jié)，暗示在其基因的5'-端可能存在順式調控元件與反式作用因子相互作用調控基因的轉錄。已有的研究表明，在lipC 5'-端存在2個蛋白質結合元件--PBE1和PBE2。本研究在這一工作的基礎上做了如下兩方面的研究工作。 首先，分別以PBE1、PBE2和PBE1+PBE2為釣餌，利用酵母單雜交技術對低氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d P. chrysosporium的cDNA文庫進行篩

3、選，研究結果表明：以PBE1為釣餌篩選到9個cDNA序列；以PBE2為釣餌篩選到的6個序列：以PBE1+PBE2為釣餌所篩選到10個序列。對這25個cDNA序列進行了較系統(tǒng)的生物信息學分析。結果表明，只有4個序列編碼的蛋白質能定位在細胞核中，編號是PBE1-A20.3、PBE1-A12.4、PBE2-A5.1和PBE1-2-A27.1，因此對這4個克隆進行了較深入的分析。序列分析表明，PBE1-A20.3編碼一種未知蛋白；PBE2-A1

4、2.4編碼的蛋白質與多功能蛋白14-3-3有較高的同源性，而14-3-3蛋白參與細胞凋亡、細胞分裂、信號轉導、蛋白跨膜轉運、基因轉錄等眾多重要生命活動過程，14-3-3蛋白主要以蛋白質-蛋白質相互作用的方式發(fā)揮功能。在動物、植物以及酵母中，14-3-3還可以與十字型DNA結合調節(jié)DNA復制。功能位點分析表明，PBE2-A5.1編碼蛋白質含有1個ATP結合結構域和1個亮氨酸拉鏈結構，很多調控蛋白質中含有亮氨酸拉鏈結構，包括CCATT盒及增

5、強子結合蛋白、cAMP應答元件(CRE)結合蛋白、酵母一般調控蛋白GCN4、octamer-結合轉錄因子2(Oct-2/OTF-2)等。PBE1-2-A27-1編碼的蛋白質含HIT(histidine triad)結構域，含該結構的蛋白可以與核酸結合。 為進一步鑒定酵母單雜交篩選到的陽性克隆與順式元件的結合作用，利用pET-28a載體對篩選到的14-3-3蛋白編碼序列進行原核生物表達，SDS-PAGE分析表明，14-3-3蛋白在

6、Escherichia.coli BL21中以部分包涵體和部分可溶性形式存在，分子量為33 kD。通過Ni柱純化得到E.coli中可溶表達的14-3-3蛋白，并用透析和PEG20000濃縮該蛋白用于體外結合實驗(GMSA)。表達的14-3-3蛋白與<'32>p標記的PBE1+PBE2探針混合后，經低離子強度聚丙烯酰胺凝膠電泳、放射自顯影表明，14-3-3蛋白電泳有明顯的延遲現象，當加入40倍的冷探針后，延遲現象減弱，加大14-3-3蛋白

7、量后，延遲現象增強，表明14-3-3蛋白可以與該探針特異結合。 在上述研究工作基礎上，以14-3-3蛋白為釣餌，利用酵母雙雜交技術篩選P. chrysosporium 3d cDNA文庫，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培養(yǎng)基平板上共獲得了約601個單克隆。進一步分析發(fā)現，只有少部分克隆可激活3個報告基因。分離自這些克隆中的質粒DNA轉化大腸桿菌，利用HaeⅢ和Sau3AI限制酶切分析可將其分為9類。序列測定和

8、同源分析結果表明，測定的6個序列均具有多個潛在的磷酸化位點，也是14-3-3蛋白潛在的結合位點。其中有2個序列具有WD結構域，表明14-3-3蛋白在P.chrysosporium中也是一個多功能蛋白質。Y2H147與轉錄因子有一定相似性。高級結構分析顯示，P. chrysosporium中的14-3-3蛋白與其它物種中的一樣，含有9個Helix結構，且可以形成杯狀的同源二聚體結構。蛋白質.蛋白質預測結果顯示，14-3-3蛋白可以與Y2H