高效過氧化物酶基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、木素過氧化物酶(Ligninperoxidase，Lip)是一種由黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)分泌的單血紅素糖蛋白。利用黃孢原毛平革菌生產(chǎn)木素過氧化物酶受到許多因素的限制。例如：只有在限氮或其他不均衡的培養(yǎng)基中才能分泌木質(zhì)素過氧化物酶并且酶活性較低。 本論文以黃孢原毛平革菌為出發(fā)菌株，研究了LipH8基因在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)BM中的表達(dá)，構(gòu)建了一株能分泌

2、Lip酶的基因工程菌BM413。 從黃孢原毛平革菌提取RNA，以此RNA為模板，根據(jù)GeneBank上已有的黃孢原毛平革菌的木質(zhì)素過氧化物酶的編碼序列，設(shè)計一對引物，根據(jù)引物的Tm值和GC含量選擇適宜的PCR條件，通過RT-PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴增，得到了去掉自身信號肽的木質(zhì)素過氧化物酶基因(LipH8)；將LipH8基因克隆到載體pUC18，獲得克隆載體pUC18-LipH8，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109；經(jīng)過雙酶切電泳檢驗所得到的基

3、因與報道的木質(zhì)素過氧化物酶基因片斷大小完全一致。將木質(zhì)素過氧化物酶基因(LipH8)克隆到芽孢桿菌—大腸桿菌穿梭載體pHY300PLK，轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌中，獲得巨大芽孢桿菌質(zhì)粒pHY300PLK-LipH8；表達(dá)質(zhì)粒pHY300PLK-LipH8經(jīng)過線性化后，利用巨大芽孢桿菌BM在對數(shù)生長后期開始形成的的自然感受態(tài)，轉(zhuǎn)入BM中。用BamHI和EcoRI雙酶切并電泳檢驗，木質(zhì)素過氧化物酶活力測定等方法鑒定，表明去除自身信號肽的黃孢原毛平革

4、菌木質(zhì)素過氧化物酶基因(LipH8)在BM中得到了表達(dá)。 通過測定對比原巨大芽孢桿菌BM和轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒pHY300PLK-LipH8的經(jīng)過基因重組的巨大芽孢桿菌BM413的木質(zhì)素過氧化物酶活性和幾丁質(zhì)酶活性，可知BM413中木質(zhì)素過氧化物酶活性比原來菌提高了108％；幾丁質(zhì)酶活性比原巨大芽孢桿菌提高了198％。 巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)在高溫等極端環(huán)境中有著較強的耐受性和廣泛的底物特異性，木質(zhì)素過氧化物酶基因的成功轉(zhuǎn)入對其在