錳過氧化物酶基因在畢赤酵母中的表達及其降解玉米秸稈中木質(zhì)素能力的研究.pdf

1、由于經(jīng)濟發(fā)展帶動養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，我們會面臨著飼料供不應(yīng)求的問題。而我國是農(nóng)業(yè)大國，每年有7億噸秸稈產(chǎn)生，由于技術(shù)條件缺乏，秸稈未能充分利用，大部分被焚燒和腐爛掉，造成資源流失和環(huán)境污染問題。因而，把秸稈轉(zhuǎn)化為動物的飼料資源具有非常重要的社會和經(jīng)濟意義。
　　木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜很難在常規(guī)條件下降解，木質(zhì)素和半纖維素是以共價鍵形式結(jié)合存在于植物細胞壁中，并且木質(zhì)素將纖維素分子包埋在內(nèi)，形成非常復(fù)雜的聚合物，使降解纖維素的酶與纖維素分子接

2、觸困難。所以要想徹底降解纖維素，必須先通過微生物和酶等生物技術(shù)手段降解木質(zhì)素。降解木質(zhì)素的酶現(xiàn)階段主要研究的有三種:漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶。本試驗通過錳過氧化物酶基因異源表達，提高產(chǎn)酶能力，充分降解秸稈中的木質(zhì)素。
　　通過從黃孢原毛平革菌中提取錳過氧化物酶基因，將目的基因與克隆載體PMD19-T連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。驗證目的基因長度與序列正確后，將目的基因與表達載體pGAPZαA連接，通過轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸

3、桿菌DH5α驗證重組質(zhì)粒連接正確。再將攜帶目的基因的重組質(zhì)粒，通過高壓電擊手段轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33中，并研究重組酵母的產(chǎn)酶情況，酶的最適溫度和pH，以及對木質(zhì)素的降解能力。
　　對本研究所獲得的錳過氧化物酶基因堿基序列進行分析，與GeneBank中錳過氧化物酶基因（編號L29039.1）序列的同源性為98.4％，蛋白質(zhì)同源性達到99.0％，由382個氨基酸組成，分子量為40.08 KDa。用SDS-PAGE蛋白電泳檢測重組酵母液

4、體發(fā)酵的粗酶液，在40.08 KDa處有條帶，說明異源表達成功。在同等液體發(fā)酵條件下，黃孢原毛平革菌只有在培養(yǎng)72 h時可以測到酶活，酶活達到0.1972 U/mL;而重組酵母在培養(yǎng)48 h時酶活達到最大值為0.3178U/mL(P＜0.05)，提高了1.56倍。另外，重組酵母在培養(yǎng)到72 h時酶活降低至0.1862 U/mL。兩種菌所產(chǎn)酶的最適溫度均為40℃，最適pH均為4.5(P＜0.05)。在同等液體發(fā)酵條件下，重組酵母木質(zhì)素降解