豬抵抗素和內(nèi)臟脂肪素基因的克隆、表達(dá)與豬抵抗素多克隆抗體制備研究.pdf

1、抵抗素(resistin)和內(nèi)臟脂肪素(visfatin)是最新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)脂肪細(xì)胞因子，二者與肥胖、脂肪組織的形成以及代謝綜合癥的產(chǎn)生密切相關(guān)。本課題以長(zhǎng)白豬為研究對(duì)象，克隆并優(yōu)化表達(dá)了豬抵抗素和內(nèi)臟脂肪素基因，制備了豬抵抗素多克隆抗體，構(gòu)建了豬內(nèi)臟脂肪素真核表達(dá)載體。本課題為研究抵抗素和內(nèi)臟脂肪素對(duì)脂肪代謝作用機(jī)制以及瘦肉型豬的選擇育種提供了相關(guān)資料，也可為進(jìn)一步研究抵抗素和內(nèi)臟脂肪素在代謝綜合癥中的作用機(jī)制以及代謝綜合癥類疾病治療藥

2、物的研制提供參考。主要研究結(jié)果如下： 1.序列克隆與分析：根據(jù)GenBank序列信息，應(yīng)用RT-PCR，從長(zhǎng)白豬腸系膜脂肪組織cDNA文庫(kù)克隆出約360bp抵抗素編碼區(qū)序列和約1.5kb內(nèi)臟脂肪素編碼區(qū)序列，并已提交美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(EU1707339)。序列分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白豬與梅山豬抵抗素編碼區(qū)序列完全一致，而內(nèi)臟脂肪素CDS區(qū)第47位和第115位存在堿基差異(分別為A-G和T-C轉(zhuǎn)換)。

3、 2.豬抵抗素原核表達(dá)載體pGEX-KG-Rest構(gòu)建與高效表達(dá)條件：根據(jù)已克隆的長(zhǎng)白豬抵抗素序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增成熟肽編碼區(qū)、酶切、亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG，經(jīng)宿主菌篩選后，進(jìn)行培養(yǎng)基pH值以及誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度等條件優(yōu)化研究。pGEX-KG-Rest高效表達(dá)條件為：誘導(dǎo)最佳時(shí)間3h；IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.3mmol/L；30℃優(yōu)于37℃誘導(dǎo)；Rosetta表達(dá)菌

4、優(yōu)于BL21表達(dá)菌；培養(yǎng)基pH6.5和pH7.8時(shí)表達(dá)量較高。 3.兔抗豬抵抗素融合蛋白多克隆抗體制備：選取最佳表達(dá)菌株，制備豬抵抗素重組蛋白，包涵體提取和蛋白復(fù)性后，用弗氏佐劑混合免疫新西蘭大耳兔，3次免疫后獲得較高效價(jià)(1:16)兔抗豬抵抗素融合蛋白多克隆抗體。 4.豬內(nèi)臟脂肪素原核表達(dá)載體pGEX-KG-Vis構(gòu)建與高效表達(dá)條件：根據(jù)已克隆內(nèi)臟脂肪素基因序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)CDS區(qū)引物。PCR擴(kuò)增、酶切、亞克隆至

5、原核表達(dá)載體pGEX-KG，經(jīng)表達(dá)宿主菌株篩選后，進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)濃度梯度研究和SDS-PAGE檢測(cè)鑒定。pGEX-KG-Vis高效表達(dá)條件為：誘導(dǎo)最佳時(shí)間2h，誘導(dǎo)最佳IPTG濃度0.1mmol/L，Rosetta表達(dá)菌優(yōu)于表達(dá)菌BL21。 5.豬內(nèi)臟脂肪素真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Vis構(gòu)建：根據(jù)已克隆的內(nèi)臟脂肪素基因序列和pcDNA3.1(+)載體信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)CDS的引物，PCR擴(kuò)增、酶