人抵抗素基因cDNA克隆及其在肥胖癥脂肪組織中的表達(dá).pdf

1、研究之一人抵抗素基因cDNA克隆;目的獲取中國漢族人抵抗素(resistin)基因的克隆質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究抵抗素基因提供物質(zhì)基礎(chǔ).方法按RNeasy Mini Kit操作說明從網(wǎng)膜脂肪組織提取總RNA,凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量,紫外分光光度法檢測總RNA的純度和濃度;根據(jù)報(bào)道的人resistin基因序列(GI:14211896),用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)特異性引物,以總RNA為模板,通過RT-PCR的方法逆轉(zhuǎn)錄合成完整resistin基因cDN

2、A,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析并BamHI酶切鑒定;經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收純化,再A-T連接到載體PMD18T載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌,藍(lán)白斑篩選陽性菌落,再搖菌擴(kuò)增,QIAprep Spin Miniprep Kit抽提質(zhì)粒;最后EcoRI、HindⅢ酶切鑒定后,進(jìn)行核苷酸序列分析.結(jié)果總RNA電泳清晰顯示28S、18S、5S三條帶,28S/18S約2:1,A<,260>/A<,28

3、0>=1.9,表明提取的總RNA純度高,其濃度為1μg/μ1;RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后于紫外分析儀下可見在250bp與500bp之間有唯一清晰的條帶,和擴(kuò)增目的基因片段的理論長度363bp一致;RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI內(nèi)切酶切后得到兩條帶,片段大小分別與理論值239bp與124bp相符,進(jìn)一步證明擴(kuò)增目的片段的正確性;重組質(zhì)粒pMD18-T-RETN經(jīng)EcoRI和HindⅢ內(nèi)切酶雙酶切后也為兩條帶,其大小與pMD18-T-RET

4、N經(jīng)上述雙酶切后所得到片段理論長度2635bp與420bp一致,說明RT-PCR產(chǎn)物準(zhǔn)確插入pMD18-T載體.核苷酸序列分析的堿基序列與Genbank報(bào)道基本一致,僅第23氨基酸位由Ser(TCC)變成Phe(TTC).結(jié)論成功克隆中國漢族人resistin基因cDNA.研究之二人抵抗素基因mRNA在肥胖癥脂肪組織中的表達(dá);目的觀察抵抗素(resistin)基因在中國漢族人腹部皮下和網(wǎng)膜脂肪組織中的表達(dá)及其與空腹血漿葡萄糖(FPG)、

5、血漿胰島素(FINS)、血脂、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和體重指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)的相關(guān)性.方法從網(wǎng)膜脂肪組織提取總RNA,以肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參照,通過半定量RT-PCR的方法檢測19名肥胖癥(BMI≥25Kg/m<'2>)腹部皮下和網(wǎng)膜脂肪組織抵抗素的表達(dá)量,采用29名非肥胖(BMI<25Kg/m<'2>)作對(duì)照,同時(shí)檢測空腹血漿胰島素、空腹血漿葡萄糖和血脂水平.結(jié)果1.

6、腹部皮下和網(wǎng)膜脂肪組織的抵抗素基因mRNA表達(dá)量的比較,肥胖組與正常組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);肥胖組內(nèi)腹部皮下和網(wǎng)膜脂肪組織的的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);2.腹部皮下和網(wǎng)膜脂肪組織的抵抗素基因mRNA表達(dá)量與其他因素均無關(guān)聯(lián)(P>0.05);多元逐步回歸分析顯示,腹部皮下脂肪組織抵抗素基因mRNA表達(dá)量和網(wǎng)膜脂肪組織相關(guān)(β=0.283,R<'2>=0.061,P=0.05)3.肥胖組血漿胰島素水平明顯高于正常