用于改善生物大分子藥物功效的超多孔水凝膠、納米粒新型給藥載體.pdf

1、隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,以往單一學(xué)科及其技術(shù)難以解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題經(jīng)多學(xué)科交叉及技術(shù)的使用獲得突破。本文運(yùn)用生物科學(xué)、材料科學(xué)、納米科學(xué)及藥劑學(xué)等學(xué)科的理論和方法,研究可顯著改善蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物及DNA、siRNA功效的新型給藥載體及其作用機(jī)理。
　　蛋白質(zhì)多肽、核酸等生物大分子藥物藥理活性強(qiáng)、特異性高,在腫瘤、糖尿病、感染性疾病等重大疾病的治療中顯示出巨大潛力,但其臨床應(yīng)用主要為注射劑型,多數(shù)藥物半衰期短,長(zhǎng)期用藥患者順應(yīng)性差。

2、而非注射給藥特別是口服給藥時(shí),此類(lèi)親水性生物大分子藥物不易被親脂性的生物膜攝取,易被體內(nèi)各種酶降解導(dǎo)致活性降低或失活,生物利用度低。利用給藥系統(tǒng)(DrugDeliverySystem,DDS)可提高生物大分子藥物的體內(nèi)外穩(wěn)定性、促進(jìn)藥物吸收、改善藥物體內(nèi)作用功效。其中水凝膠給藥載體還可控制藥物釋放,具有生物黏附、生物相容和生物可降解等特性;納米給藥載體還可增溶難溶性藥物,緩控釋藥物和靶向給藥。
　　同時(shí)具有抑制蛋白酶活性、促進(jìn)藥物

3、滲透及黏膜黏附等性質(zhì)的多功能聚合物給藥載體可顯著提高蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物的口服吸收,能有效突破胞外屏障(吞噬系統(tǒng)、核酸酶)和胞內(nèi)屏障(細(xì)胞膜、內(nèi)涵體、溶酶體、核膜)的多功能非病毒基因載體有望持續(xù)、高效地將基因?qū)氚屑?xì)胞和靶組織。據(jù)此,設(shè)計(jì)并研究新型互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物超多孔水凝膠(SPH-IPN),以胰島素為模型藥物,研究SPH-IPN促進(jìn)蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物的口服吸收及作用機(jī)理:依據(jù)殼聚糖季胺鹽(TMC)與巰基化聚合物黏膜黏附及促滲特點(diǎn),設(shè)計(jì)一種新

4、型殼聚糖多功能衍生物-巰基化殼聚糖季胺鹽(TMC-Cys),以胰島素和pEGFP分別作為模型蛋白質(zhì)藥物和模型基因,研究其自組裝納米載體促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物口服吸收、基因轉(zhuǎn)染及其作用機(jī)理:對(duì)TMC-Cys納米載體進(jìn)行甘露糖配體修飾,以TNF-αsiRNA為靶基因,研究甘露糖修飾的TMC-Cys(MTC)納米載體對(duì)小腸M細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用及增加siRNA口服給藥功效與作用機(jī)理。
　　1.SPH-IPN的制備和表征
　　以丙烯

5、酸(AA)和丙烯酰胺(AM)為單體,過(guò)硫酸銨(APS)/N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)為引發(fā)體系,NaHCO3為起泡劑,N,N’-亞甲基-雙丙烯酰胺(Bis)為交聯(lián)劑,溶液聚合制得聚(丙烯酸-丙烯酰胺)(P(AA-co-AM))超多孔水凝膠;采用分步互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物技術(shù),聚合時(shí)加入O-羧甲基殼聚糖(O-CMC),膠凝后以戊二醛(GA)交聯(lián)O-CMC;制得SPH-IPN。傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、核磁共振(13CNMR

6、)、差示掃描量熱分析(DSC)等研究表明SPH-IPN中含有P(AA-co-AM)和交聯(lián)的O-CMC;掃描電鏡(SEM)、光鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀(guān)察表明SPH-IPN含有大量相互連接、直徑100-300μm的孔隙,O-CMC圍繞孔隙邊緣分布。SPH-IPN孔隙率大于80％,水中可快速溶脹,平衡溶脹比30-80,SPH-IPN的溶脹比隨O-CMC含量增加、交聯(lián)度增加、交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)而降低。引入互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物(IPN)結(jié)構(gòu)可顯

7、著提高SPH-IPN的壓縮模量和拉伸模量;壓縮模量和拉伸模量均隨O-CMC含量增加而顯著提高:壓縮模量隨O-CMC交聯(lián)度增加、交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)而顯著提高。
　　2.SPH-IPN的刺激敏感性溶脹及載藥和釋藥特性
　　考察pH、離子強(qiáng)度和溫度對(duì)SPH-IPN溶脹行為的影響;以胰島素為模型藥物,研究SPH-IPN的載藥量、載胰島素SPH-IPN在不同介質(zhì)中的體外釋放行為、載藥前后胰島素的穩(wěn)定性及聚合物-藥物相互作用;研究SPH-IP

8、N中水的狀態(tài)及保水性。
　　研究表明,SPH-IPN的溶脹具有離子強(qiáng)度、pH和溫度敏感性。離子強(qiáng)度≥0.0lmol·L-1時(shí),SPH-IPN的溶脹比隨離子強(qiáng)度增大而減小;離子強(qiáng)度≤0.001mol·L-1時(shí),溶脹不受影響。pH≤3.0時(shí)SPI-IPN幾乎不溶脹;3.0≤pH≤6.2時(shí)隨pH升高溶脹速率加快,溶脹比增大;pH≥6.2時(shí)溶脹充分,溶脹行為無(wú)顯著改變;SPH-IPN對(duì)脈沖式pH改變可快速響應(yīng),呈現(xiàn)可逆的溶脹-去溶脹行為。

9、溫度升高可促進(jìn)SPH-IPN的溶脹。SPH-IPN對(duì)胰島素吸附載藥的載藥量為4％-7％,顯著高于傳統(tǒng)超多孔水凝膠(CSPH);載藥量隨O-CMC含量增加而略有降低。胰島素體外釋放對(duì)離子強(qiáng)度、pH和溫度敏感。圓二色譜分析和生物活性檢測(cè)結(jié)果表明載藥前后胰島素的構(gòu)象和生物活性無(wú)顯著變化。SPH-IPN對(duì)胰島素的實(shí)際載藥率顯著高于理論載藥率,pH7.4PBS介質(zhì)中藥物可快速、完全釋放,空白SPH-IPN和釋藥后SPH-IPN的FTIR圖譜相似,

10、表明SPH-IPN與胰島素間存在較強(qiáng)的物理相互作用,不存在化學(xué)共價(jià)連接。溶脹的SPH-IPN中可凍結(jié)水占主要部分;SPH-IPN與水分子形成氫鍵的作用隨O-CMC含量和胰島素載藥量增加而減弱。外加壓力與37℃孵育時(shí),SPH-IPN保水性較好,保水性隨O-CMC含量增加而提高。
　　3.SPH-IPN增加胰島素口服吸收及促吸收機(jī)理
　　考察載胰島素SPH-IPN正常大鼠口服給藥和回腸給藥的生物利用度,以及糖尿病模型大鼠口服給藥

11、降血糖效果;從黏膜黏附、蛋白酶抑制、滲透促進(jìn)、小腸滯留等方面探討SPH-IPN促胰島素腸道吸收機(jī)理;考察聚合物結(jié)構(gòu)完整性對(duì)SPH-IPN抑酶、促滲、小腸滯留及胰島素口服吸收的影響。
　　正常大鼠口服載胰島素完整的SPH-IPN(I-SPH-IPN)后藥物吸收和降血糖效果顯著,血糖最低降至初始值的65％,相對(duì)皮下注射的口服生物利用度為5.0％,藥理生物利用度為6.3％;口服載胰島素粉碎的SPH-IPN(P-SPH-IPN)后藥物吸收

12、和降血糖效果均不明顯;回腸給予載胰島素I-SPH-IPN和P-SPH-IPN時(shí),藥物吸收和降血糖效果顯著,血糖最低降至初始值的30％,二者效果相當(dāng),均優(yōu)于口服給藥;糖尿病模型大鼠口服載胰島素I-SPH-IPN后降血糖效果顯著。SPH-IPN可通過(guò)非特異性作用和機(jī)械作用黏附至小腸黏膜,黏附力隨O-CMC含量增加而增大。SPH-IPN可通過(guò)捕獲蛋白酶溶液和絡(luò)合Ca2+抑制腸腔蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶)活性,且SPH-IPN絡(luò)合二價(jià)金屬離子

13、的能力隨O-CMC含量增加而增強(qiáng),抑酶作用相應(yīng)增強(qiáng)。I-SPH-IPN和P-SPH-IPN的體外抑酶作用相當(dāng),I-SPH-IPN可減少藥物在腸腔中的釋放,增加黏液層和黏膜中的釋放,從而降低腸腔蛋白酶對(duì)藥物的降解,I-SPH-IPN對(duì)胰島素的保護(hù)作用強(qiáng)于P-SPH-IPN。SPH-IPN通過(guò)機(jī)械作用可逆打開(kāi)小腸上皮細(xì)胞間緊密連接,促進(jìn)胰島素的胞間轉(zhuǎn)運(yùn);加入I-SPH-IPN和P-SPH-IPN,Caco-2細(xì)胞單層的跨膜電阻最低分別降至初

14、始值的25％和50％,FITC-胰島素在Caco-2細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)量分別提高至未加聚合物的4.9和1.9倍,離體小腸中的Papp分別提高至4.2和1.8倍,表明I-SPH-IPN打開(kāi)上皮細(xì)胞間緊密連接和促胰島素滲透的能力強(qiáng)于P-SPH-IPN。I-SPH-IPN通過(guò)機(jī)械作用固定于大鼠小腸壁,小腸滯留時(shí)間超過(guò)8h;P-SPH-IPN在小腸中易分散,無(wú)法通過(guò)機(jī)械作用固定于腸壁,滯留時(shí)間短于4h。
　　4.SPH-IPN的生物相容性<

15、br>　　考察SPH-IPN的細(xì)胞毒性、基因(遺傳)毒性、小腸組織相容性、口服急性、亞急性毒性和血液相容性,從整體動(dòng)物、組織、細(xì)胞和分子水平評(píng)價(jià)SPH-IPN的安全性;HPLC測(cè)定SPH-IPN中單體和交聯(lián)劑的殘留量,為生物相容性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
　　FDA／PI雙染色、LDH、中性紅、蛋白質(zhì)含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明RBL-2H3和Caco-2細(xì)胞與SPH-IPN及其浸提液(1O、1、0.1mg·mL-1)短時(shí)程(24h)接觸后,胞外L

16、DH釋放量、胞內(nèi)中性紅攝入量、蛋白質(zhì)含量均無(wú)顯著變化,細(xì)胞活力無(wú)顯著影響;MTT試驗(yàn)結(jié)果表明二種細(xì)胞與SPH-IPN及其浸提液長(zhǎng)時(shí)程(7d)接觸后,細(xì)胞增殖率無(wú)顯著影響,SPH-IPN細(xì)胞毒性低。DNALadder、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、單細(xì)胞凝膠電泳和小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果表明SPH-IPN不會(huì)引起RBL-2H3和Caco-2細(xì)胞凋亡、DNA斷裂和小鼠骨髓微核發(fā)生,基因毒性低。SPH-IPN不會(huì)引起大鼠小腸黏膜組織損傷,組織相容性良好。SPH

17、-IPN浸提液小鼠灌胃給藥最大耐受劑量為1000mg·kg-1；亞急性毒性試驗(yàn)中連續(xù)28天每天一次灌胃給予SPH-IPN浸提液(500、200、100mg.kg-1),小鼠體重增長(zhǎng)正常,血液學(xué)和血清生化指標(biāo)正常,肝、腎、脾重量正常,組織切片中未見(jiàn)炎癥、壞死、水腫等病理現(xiàn)象,肝、腎、脾中ACP、ALKP、GPT、GOT和LPO含量正常,表明SPH-IPN口服安全性好。SPH-IPN的溶血率低于5％,動(dòng)態(tài)凝血率低于硅化玻璃,血小板黏附率低,

18、具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。SPH-IPN中AA、AM和GA的殘留量分別為1.4±0.6、2.0±0.2、<0.2ppm,符合其限量規(guī)定。
　　5.巰基化殼聚糖季胺鹽自組裝納米粒增加胰島素口服吸收及其作用機(jī)理
　　殼聚糖經(jīng)季胺化和巰基化修飾制備TMC-Cys,表征理化性質(zhì);聚電解質(zhì)(PEC)法制備TMC-Cys／胰島素自組裝納米粒(TMC-CysNP)并表征理化性質(zhì);考察TMC-CysNP正常大鼠口服給藥和回腸給藥

19、的降血糖效果,研究TMC-CysNP促胰島素口服吸收機(jī)理。
　　殼聚糖(Mw30、200、500kDa)與碘甲烷反應(yīng)合成季胺化度分別為15％和30％的TMC,TMC與Cys經(jīng)EDAC／NHS催化的縮合反應(yīng)合成FMC-Cys。400-500μmol·g-1Cys共價(jià)連接至TMC,其中約35％為游離巰基,其余為二硫鍵;游離巰基在中性條件下可氧化形成二硫鍵。FTIR和13CNMR表明TMC與Cys以酰胺鍵連接,DSC和TGA結(jié)果表明季胺

20、化和巰基化修飾可改變殼聚糖的結(jié)晶度,降低其熱穩(wěn)定性。TMC-Cys的抑菌作用與TMC相近,清除自由基作用強(qiáng)于TMC,季胺化度較高時(shí)抑菌作用較強(qiáng),清除自由基能力減弱。荷正電的TMC-Cys與荷負(fù)電的胰島素經(jīng)靜電作用自組裝形成TMC-CysNP,納米粒呈球形,分散度良好,粒徑為100-170nm,Zeta電勢(shì)為+12-+18mV,胰島素包封率達(dá)90％。納米粒粒徑、Zeta電勢(shì)和包封率受胰島素溶液pH、TMC-Cys／胰島素質(zhì)量比和離子強(qiáng)度影

21、響;胰島素體外釋放受殼聚糖分子量、季胺化度、釋放介質(zhì)離子強(qiáng)度和離子類(lèi)型影響。TMC-CysNP的小腸黏膜黏附力和黏蛋白黏附率較TMCNP分別提高2.1-4.7倍和1.5-2.2倍,黏蛋白黏附率隨殼聚糖分子量或季胺化度升高而增加。DSC分析表明TMC-Cys通過(guò)與黏蛋白間形成二硫鍵提高黏附力。與TMCNP相比,TMC-CysNP胰島素的離體小腸Papp提高1.7-2.6倍,Caco-2細(xì)胞攝取量提高1.7-3.0倍,Peyer’s結(jié)攝取量

22、提高1.7-5.0倍,其中TMC-Cys(200,30)NP的促滲作用最強(qiáng)。大鼠口服和回腸給藥時(shí),TMC-CysNP的降血糖效果優(yōu)于TMCNP,血糖最低分別降至初始值的65％和30％。Caco-2細(xì)胞MTT試驗(yàn)和大鼠回腸LDH試驗(yàn)結(jié)果表明TMC-CysNP細(xì)胞毒性低,安全性良好。
　　6.巰基化殼聚糖季胺鹽納米載體增加基因轉(zhuǎn)染效率及其作用機(jī)理
　　以增強(qiáng)型綠熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP)為模式質(zhì)粒,PEC法制備TMC-Cys

23、/pEGFP自組裝納米復(fù)合物(TMC-CysNC)并表征理化性質(zhì);考察TMC-CysNC在HEK293細(xì)胞和小鼠脛前肌中的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率,研究其轉(zhuǎn)染機(jī)制。
　　TMC-CysNC呈球形,分散度良好,粒徑為150-400nm,Zeta電勢(shì)為+14-+20mV;凝膠阻滯試驗(yàn)結(jié)果表明TMC-Cys可通過(guò)靜電作用縮合pDNA;TMC-CysNC可有效保護(hù)pDNA免受核酶降解。TMC-CysNC的細(xì)胞黏附率較TMCNC顯著提高;TMC-Cy

24、sNC的HEK293細(xì)胞攝取率分別提高至TMCNC和Lipofectamine2000的1.4-3.0倍和1.6-4.4倍;4℃時(shí)TMC-CysNC的攝取量為37℃時(shí)的25％,疊氮鈉和氯丙嗪處理分別使攝取量減少40％和70％,表明TMC-CysNC主要經(jīng)能量依賴(lài)的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)胞;松胞素D和染料木素對(duì)TMC-CysNC的攝取無(wú)顯著影響,表明進(jìn)胞機(jī)理與細(xì)胞骨架的重構(gòu)和窖蛋白介導(dǎo)的通路無(wú)關(guān)。TMC-CysNC的釋放行為呈現(xiàn)谷胱

25、甘肽(GSH)濃度依賴(lài)性,胞外GSH濃度下緩慢釋放pEGFP,胞內(nèi)GSH濃度下快速釋放pEGFP并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)核,細(xì)胞核中pEGFP的含量為T(mén)MCNC組的3.7倍。TMC-CysNC在HEK293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率提高至TMCNC的1.4-3.2倍,其中TMC-Cys(100,30)NC的轉(zhuǎn)染效率最高(約35％),為L(zhǎng)ipofectamine2000的1.5倍。TMC-Cys(100.30)NC的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率分別提高至TMCNC和Lipofec

26、tamine2000的2.3倍和4.1倍。
　　7.靶向M細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的MTC納米載體增加siRNA口服給藥功效及其作用機(jī)理
　　制備MTC及其納米粒,研究納米粒的理化性質(zhì);以TNF-αsiRNA為靶基因,研究MTC納米粒對(duì)小腸M細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用和提高siRNA口服給藥功效及其作用機(jī)理。
　　TMC(200、500kDa)經(jīng)甘露糖修飾和巰基化修飾制得甘露糖修飾度約20％的MTC:捕獲法、吸附法和自組裝法分

27、別制各載siRNAMTC納米粒(en-MTC-TPPNP、ad-MTC-TPPNP和MTC-SANP),納米粒為球形或亞球形,分散良好,粒徑為130-230nm,Zeta電勢(shì)為正值,siRNA包封率為70-80％,納米?？娠@著提高siRNA的血清穩(wěn)定性:納米粒粒徑隨殼聚糖分子量增大而增大;ad-MTC-TPPNP和MTC-SANP受離子強(qiáng)度影響較大,siRNA包封率隨離子強(qiáng)度升高而顯著降低,但en-MTC-TPPNP受離子強(qiáng)度影響較小。

28、與載NCsiRNA的巰基化殼聚糖季胺鹽納米粒(en-TC-TPPNP)相比,en-MTC-TPPNP的Caco-2細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞黏附力顯著提高,siRNA在Raw264.7細(xì)胞中的攝取量提高2.0-2.4倍,Peyer’S結(jié)攝取量提高1.9-2.4倍,體外M細(xì)胞模型和Caco-2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)量提高1.2-2.1倍,離體小腸轉(zhuǎn)運(yùn)量提高6.9-11.0倍,且M細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著高于Caco-2細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)量,含Peyer

29、’s結(jié)離體小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)量高于不含Peyer’s結(jié)離體小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)量,表明甘露糖配體修飾載體可通過(guò)特異性配體-受體結(jié)合作用顯著提高納米粒對(duì)M細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用,從而促進(jìn)siRNA的小腸攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。以TNF-αsiRNA為靶基因,en-MTC-TPPNP在Raw264.7細(xì)胞中的干擾效率顯著強(qiáng)于en-TC-TPPNP和Lipofectamine2000;相同干擾效率(70％)時(shí),en-MTC-TPPNP的siRNA劑量較Lipofec