幽門螺桿菌分泌蛋白粗提物對(duì)胃酸分泌及胃上皮細(xì)胞增殖凋亡的影響.pdf

1、自幽門螺桿菌發(fā)現(xiàn)至今已有20多年，盡管對(duì)幽門螺桿菌及其相關(guān)疾病的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但其感染造成慢性胃炎、萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤等不同臨床結(jié)局的機(jī)制研究仍然是一個(gè)廣為關(guān)注的熱點(diǎn)。一般認(rèn)為，導(dǎo)致不同疾病發(fā)生的原因除與宿主本身遺傳特性和環(huán)境因素有關(guān)外，致病原的某些特性也是主要原因。宿主在不同毒力活性的菌株的作用下，胃腸上皮細(xì)胞是增殖還是凋亡、胃酸分泌水平是升高還是減低，都將直接導(dǎo)致不同的臨床病理改變。

2、 作為幽門螺桿菌主要毒力因子之一的空泡細(xì)胞毒素(VacA)，因分泌量低、天然蛋白純化困難、重組蛋白又缺乏毒力活性等原因，在其致病性的研究上遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于CagA。然而隨著對(duì)幽門螺桿菌研究的深入，這種不需通過細(xì)菌直接粘附便可發(fā)揮毒性作用的分泌性蛋白又漸漸引起了研究者的興趣。為此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察了從液體培養(yǎng)幽門螺桿菌上清液粗提的含有VacA的分泌蛋白對(duì)胃壁細(xì)胞酸分泌以及胃上皮細(xì)胞增殖/凋亡的調(diào)控作用。 1.液體培養(yǎng)V

3、acA+幽門螺桿菌上清液粗提蛋白對(duì)離體兔胃壁細(xì)胞酸分泌的影響本研究：1)應(yīng)用液體培養(yǎng)方法培養(yǎng)幽門螺桿菌(NCTC11637)，以硫酸銨沉淀法提取菌液上清蛋白(BCF-P)并進(jìn)行真空干燥濃縮，Hela細(xì)胞中性紅攝取試驗(yàn)鑒定其空泡毒素活性。2)采用淘洗和連續(xù)密度梯度離心相結(jié)合的方法獲得兔離體胃壁細(xì)胞，通過不同抑酸藥物的作用，從丫叮橙染色、14C-AP攝取、H+/K+ATP酶α亞基mRNA表達(dá)水平三個(gè)方面來鑒定分離壁細(xì)胞具有酸分泌功能。3)電

4、鏡觀察幽門螺桿菌上清液粗提蛋白對(duì)壁細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響，并從14C-AP攝取、H+-K+ATP酶mRNA表達(dá)水平兩方面分析幽門螺桿菌上清液粗提蛋白及EGF對(duì)組胺刺激的壁細(xì)胞酸分泌的影響。 研究結(jié)果顯示：1)液體培養(yǎng)幽門螺桿菌上清提取蛋白(BCF-P)中含有95KD空泡細(xì)胞毒素，對(duì)Hela細(xì)胞表現(xiàn)出空泡活性，中性紅試驗(yàn)陽性。2)抗酸藥物能顯著抑制組胺刺激壁細(xì)胞對(duì)14C-AP的攝取(P＜0.05)，并干擾基礎(chǔ)狀態(tài)下H+-K+ATP酶α亞基

5、mRNA表達(dá)，提示淘洗分離獲得的離體壁細(xì)胞具有良好的酸分泌功能。3)BCF-P作用離體培養(yǎng)兔胃壁細(xì)胞，引起壁細(xì)胞超微結(jié)果改變，破壞壁細(xì)胞分泌的微管系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生融合大泡。4)BCF-P對(duì)壁細(xì)胞泌酸功能的影響，因劑量及作用時(shí)間的不同而不同，小劑量BCF-P(50ug/ml)表現(xiàn)出急性期(1h)對(duì)壁細(xì)胞泌酸的刺激作用(P＜0.05)，隨時(shí)間延長(12h)，刺激作用消失(P＞0.05)；大劑量BCF-P(100μg/ml)作用壁細(xì)胞，能顯

6、著抑制組胺刺激的酸分泌(P＜0.05)，下調(diào)壁細(xì)胞H+-K+ATP酶表達(dá)。5)EGF早期作用(1h)能抑制組胺刺激的壁細(xì)胞酸分泌，而晚期作用(12h)則表現(xiàn)為促進(jìn)組胺刺激的壁細(xì)胞酸分泌(P＜0.05)，并可持續(xù)上調(diào)壁細(xì)胞H+-K+ATP酶表達(dá)(P＜0.05)。小結(jié)：1)液體培養(yǎng)幽門螺桿菌上清液提取蛋白(BCF-P)中含有可以使Hela細(xì)胞表現(xiàn)出空泡樣變的空泡細(xì)胞毒素(VacA)。2)BCF-P可以破壞壁細(xì)胞內(nèi)酸分泌功能相關(guān)的微管系統(tǒng)，抑

7、制胃酸分泌。3)BCF-P抑制胃酸分泌及下調(diào)H+-K+ATP酶mRNA表達(dá)的作用有劑量依賴性。4)EGF對(duì)組胺誘導(dǎo)的壁細(xì)胞酸分泌呈雙向調(diào)節(jié)性。 2.液體培養(yǎng)VacA+幽門螺桿菌上清液粗提蛋白對(duì)胃上皮細(xì)胞增殖/凋亡的影響本實(shí)驗(yàn)以人胃永生上皮細(xì)胞株(GES-1)和胃癌上皮細(xì)胞株(AGS)作為研究對(duì)象，進(jìn)行了下述研究：1)應(yīng)用MTT方法分析BCF-P對(duì)GES-1和AGS細(xì)胞增殖的影響。2)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析BCF-P對(duì)GES-1和AG

8、S細(xì)胞凋亡的影響。3)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)BCF-P和EGF對(duì)GES-1和AGS細(xì)胞FasmRNA和COX-2mRNA表達(dá)水平的影響。3)免疫沉淀和酶聯(lián)法檢測(cè)BCF-P對(duì)GES-1和AGS細(xì)胞EGFR酪氨酸激酶活性的影響。 研究結(jié)果顯示：1)BCF-P抑制GES-1和AGS細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性。2)在與抑制增殖相同的劑量和作用時(shí)間下，BCF-P未能誘導(dǎo)出GES-1和AGS細(xì)胞凋亡。3)GES-1和AGS細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下均能

9、檢測(cè)到FasmRNA表達(dá)，BCF-P作用使GES-1和AGS細(xì)胞FasmRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)；與EGF的作用一致。4)GES-1細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下未能檢測(cè)到COX-2mRNA表達(dá)；AGS細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下能檢測(cè)到COX-2mRNA表達(dá)；BCF-P使AGS細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)；而EGF作用使AGS細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。 小結(jié)：1)BCF-P體外抑制AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞增殖

10、，但未能誘導(dǎo)AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。2)BCF-P下調(diào)AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞Fas受體mRNA表達(dá)，與EGF作用一致；BCF-P下調(diào)AGS細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)，與EGF作用相反；GES-1細(xì)胞沒有COX-2mRNA表達(dá)。3)BCF-P使AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞EGFR酪氨酸激酶活性增強(qiáng)。 3.液體培養(yǎng)VacA+幽門螺桿菌上清液粗提蛋白處理的胃上皮細(xì)胞及幽門螺桿菌感染患者全基因組表達(dá)譜的檢測(cè) 本研究

11、采用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)并比較了BCF-P作用下，AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變；同時(shí)檢測(cè)了臨床感染vacA基因s1/m1b基因型消化性潰瘍的患者與基因表達(dá)譜的改變。 結(jié)果顯示：1)AGS細(xì)胞芯片結(jié)果顯示共有150個(gè)靶基因(約1.06％)表達(dá)存在明顯差異，其中未知基因22個(gè)，下調(diào)已知功能基因有88個(gè)，上調(diào)已知功能基因40個(gè)。GES-1芯片結(jié)果有137個(gè)靶基因(約0.97％)表達(dá)存在明顯差異，其中未知基因8個(gè)，下調(diào)已知功

12、能基因有40個(gè)，上調(diào)已知功能基因89個(gè)。VacA+潰瘍病患者基因芯片結(jié)果有差異表達(dá)基因174個(gè)，上調(diào)53個(gè)，下調(diào)121個(gè)。2)差異表達(dá)基因涉及細(xì)胞許多重要生命和功能活動(dòng)，如細(xì)胞代謝、細(xì)胞骨架、細(xì)胞生長與凋亡調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生。3)芯片結(jié)果證實(shí)，BCF-P不能通過Fas途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而芯片結(jié)果提示BCF-P體外對(duì)細(xì)胞增殖的抑制很可能是毒素直接干擾細(xì)胞正常代謝活動(dòng)的結(jié)果。 結(jié)論：1)BCF-P對(duì)兔離體壁細(xì)胞酸分泌有直接抑制