PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在斑馬魚研究中的應(yīng)用及文昌魚Six1基因的克隆和生物信息學(xué)分析.pdf

1、隨著斑馬魚基因組測序工作的完成，人們發(fā)現(xiàn)斑馬魚基因與人類基因的保守度高達(dá)87％，使得斑馬魚作為一種研究人類基因功能的模式動物越來越受到關(guān)注。
　　 轉(zhuǎn)座子在低等生物轉(zhuǎn)基因和基因誘變分析中得到了廣泛的應(yīng)用，對這些生物基因功能的研究起了重要作用。目前用于斑馬魚基因功能研究的轉(zhuǎn)座子主要是Tol2，結(jié)合基因捕獲技術(shù)較廣泛的被應(yīng)用于斑馬魚突變體篩選。Tol2的轉(zhuǎn)座遵循“切離-粘貼”機(jī)制，其插入基因組時(shí)會產(chǎn)生插入位點(diǎn)處8個(gè)堿基的重復(fù)，但其存

2、在切離后留下的痕跡不一的缺點(diǎn)，不易實(shí)現(xiàn)對突變表型的回復(fù)。
　　 PiggyBac轉(zhuǎn)座子(PB)是一種來源于鱗翅目昆蟲的DNA轉(zhuǎn)座子，最初的序列在粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細(xì)胞系中分離，其轉(zhuǎn)座遵循“切離-粘貼”機(jī)制，PB特異地插入到TTAA四堿基位點(diǎn)，插入的同時(shí)在其兩側(cè)形成TTAA四堿基重復(fù)。它可以從插入位點(diǎn)處精確地切離，不留下任何痕跡，使插入位點(diǎn)完全回復(fù)到插入以前的狀態(tài)。該轉(zhuǎn)座子目前已經(jīng)開發(fā)成為轉(zhuǎn)基因昆蟲中應(yīng)用最為

3、廣泛的載體之一，它己被證明能夠在四個(gè)目十?dāng)?shù)種昆蟲中轉(zhuǎn)座。2005年Ding等的研究發(fā)現(xiàn)其也能在脊椎動物如小鼠中實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)座;2006年，F(xiàn)raser等發(fā)現(xiàn)PB轉(zhuǎn)座子在斑馬魚原代培養(yǎng)細(xì)胞及胚胎中均能進(jìn)行轉(zhuǎn)座，揭示了PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在斑馬魚基因功能研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 我們對piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中的helper質(zhì)粒-轉(zhuǎn)座酶載體質(zhì)粒(pCMV-hyPBase)和donor質(zhì)粒-轉(zhuǎn)座子載體質(zhì)粒(5'-PTK-3')分

4、別進(jìn)行了重新構(gòu)建，得到了一個(gè)二元系統(tǒng)。
　　 Helper質(zhì)粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP構(gòu)建過程如下:將來源于質(zhì)粒pPRIG的IRES-EGFP片段插入到XbaI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒pCMV-hyPBase的缺口，從而構(gòu)建了雙順反子表達(dá)載體質(zhì)粒:pCMV-hyPBase-IRES-EGFP;Helper質(zhì)粒pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP構(gòu)建過程如下:將克隆得到的斑馬魚ZPC0.5啟動子插入

5、到SpeI和EcoRI雙酶切的質(zhì)粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP缺口，替換掉CMV啟動子，即得到雙順反子表達(dá)載體質(zhì)粒:pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP。
　　 Donor質(zhì)粒PTK-mCherry構(gòu)建過程如下:將以pmCherry-N1質(zhì)粒為模板克隆得到的mCherry基因片段插入到用NcoI和BclI雙酶切的質(zhì)粒5'-PTK-3'缺口，構(gòu)建得到了基因捕獲載體質(zhì)粒:PTK-mCherry。質(zhì)粒pC

6、S2+-hyPBase構(gòu)建過程如下:將來源于質(zhì)粒pCMV-hyPBase的hyPBase片段插入到用EcoRI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒pCS2+的缺口，即構(gòu)建了轉(zhuǎn)座酶hyPBasemRNA合成模板載體質(zhì)粒pCS2+-hyPBase。
　　 將pCMV-hyPBase-IRES-EGFP質(zhì)粒載體線性化后顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期受精卵中，篩選得到了EGFP遍表達(dá)的helper品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚，并且發(fā)現(xiàn)其中一些魚的這一性狀能夠穩(wěn)定傳給F

7、1代，從而得到了此轉(zhuǎn)基因品系的founder斑馬魚。
　　 以線性化的pCS2+-hyPBase為模板，體外轉(zhuǎn)錄合成了轉(zhuǎn)座酶hyPBasemRNA。將此mRNA與基因捕獲載體質(zhì)粒PTK-mCherry共注射到斑馬魚單細(xì)胞期受精卵中，篩選得到了mCherry的表達(dá)在時(shí)間及空間上均不同的donor品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚，且發(fā)現(xiàn)mCherry在F0代中有將近8％的表達(dá)率，證明piggyBac轉(zhuǎn)座子能夠在斑馬魚中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)座且捕獲到不同基因，