魚源tlr-1的生物信息學(xué)分析【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目 魚源TLR-1的生物信息學(xué)分析</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p&

2、gt;<p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠信承諾書</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴(yán)格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀點(diǎn)和參考資料均加以

3、注釋和說明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）沒有抄襲他人研究（設(shè)計(jì)）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）若有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名： __________</p><p>　　日 期： <

4、/p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本論文依次通過NCBI檢索，氨基酸序列比對，系統(tǒng)關(guān)系分析，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等方法，對多種魚類的TLR-1(TLR1)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析研究，通過其中典型的三種魚類TLR1的二級、三級結(jié)構(gòu)的模擬，比較它們之間TLR-1受體的異同，從而了解魚類間的同源性，蛋白質(zhì)的功能區(qū)別。本文通過對魚源TLRs的多重序列比對，找出序列中

5、結(jié)構(gòu)或功能相似性區(qū)域，本文通過對不同魚類的TLR-1之間的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)不同魚類的TLR-1之間的氨基酸序列相當(dāng)保守，具有很高的同源性。這幾種魚類TLR-1的氨基酸序列相似度高達(dá)80％以上。其實(shí)，340-450，520-650氨基酸片段，是他們的L（亮氨酸）富集區(qū)，基本都處于胞膜外區(qū)。通過比對序列的相似程度和進(jìn)化樹分析判定幾種魚類之間是否具有同源性；通過對三個(gè)不同魚源的二級和三級蛋白質(zhì)比對，了解不同魚源的的TLR-1空

6、間結(jié)構(gòu)基本相似，Ip-tlr-1具有24個(gè)β折疊，31個(gè)α螺旋，；Ci-tlr-1具有23個(gè)β折疊，26個(gè)α螺旋，；Tr-tlr-1具有22個(gè)β折疊，26個(gè)α螺旋。</p><p>　　關(guān)鍵詞：Toll樣受體；功能；生化特性；各級結(jié)構(gòu)</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　This thesis is thr

7、ough the NCBI retrieval, amino acid sequence alignment, system analysis, protein structure analysis and other methods, to a variety of fish TLR-1( TLR1) for data analysis, through which three kinds of typical fish TLR1tw

8、o level, three level structure simulation, compares their similarities and differences between TLR-1 receptor, thereby understanding between fish homology, protein function difference. This article through to the fish so

9、urce TLRs multiple sequence alignment, fin</p><p>　　Key words：Toll-like receptor; function; biochemical characteristics; levels of structure</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>

10、;<b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 Toll樣受體的研究現(xiàn)狀1</p><p>　　1.1.1 Toll樣受體的定義，分類簡介1</p><p>　　1.1.2 Toll樣受體的功能簡介2</p><p>　　1.1.3 Toll樣受體的對配體的識別3</p><p

11、>　　1.2 哺乳類Toll樣受體的研究現(xiàn)狀4</p><p>　　1.3 魚類Toll樣受體的研究現(xiàn)狀5</p><p><b>　　2 材料與方法6</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料6</p><p>　　2.1.1 GenBank中魚源TLR-1及類似TLR6</p>&l

12、t;p>　　2.1.2 主要生物學(xué)分析軟件和在線蛋白質(zhì)分析工具7</p><p><b>　　2.2 方法7</b></p><p>　　2.2.1 魚源TLR-1序列的檢索與整理7</p><p>　　2.2.2 序列比對及部分蛋白的基本生化特性分析7</p><p>　　2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析7&l

13、t;/p><p>　　2.2.4 魚源TLR-1受體二級結(jié)構(gòu)模擬比較分析8</p><p>　　2.2.5 魚源TLR-1受體三級結(jié)構(gòu)模擬比較分析9</p><p>　　3 結(jié)果與分析10</p><p>　　3.1 部分不同魚源TLR-1受體氨基酸序列比對10</p><p>　　3.2 部分魚源TLR-1受體氨

14、基酸基本生化特性分析12</p><p>　　3.3 11種不同魚源TLR-1受體系統(tǒng)關(guān)系比較13</p><p>　　3.4 部分魚源Toll樣受體二級結(jié)構(gòu)14</p><p>　　3.5 部分魚源TLR-1三級結(jié)構(gòu)16</p><p><b>　　4 結(jié)論17</b></p><p>

15、;<b>　　參考文獻(xiàn)19</b></p><p><b>　　致 謝21</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　1.1 Toll樣受體的研究現(xiàn)狀</p><p>　　1.1.1 Toll樣受體的定義，分類簡介</p>&

16、lt;p>　　Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR是單個(gè)的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，可以識別來源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子[1-3]。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時(shí)，TLR可以識別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。</p><p>　　所有Toll樣受體同源分子都是Ⅰ型跨膜蛋

17、白，可分為胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)3部分[3]。</p><p>　　圖1 Ci-TLR-1模擬圖</p><p>　　根據(jù)TLRs細(xì)胞分布特征，可將其分為普遍存在型(TLR1)、限制存在型(TLR2、TLR4、TLR5)及特異存在型(TLR3)3類[4]。</p><p>　　TLRs分布的細(xì)胞多達(dá)20余種，Muzio M等對TLR1-TLR5表達(dá)于人類白細(xì)胞的研

18、究中發(fā)現(xiàn)，TLR1能在包括單核細(xì)胞，多形核細(xì)胞，T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，TLR2、TLR4、TLR5只在髓源性細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)上表達(dá)，而TLR3只特異性表達(dá)于樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)[5-7]。</p><p>　　1.1.2 Toll樣受體的功能簡介</p><p>　　Toll樣受體在天然免疫中具有識別作用，它如同天然免疫的眼睛，監(jiān)視與

19、識別各種不同的疾病相關(guān)分子模式（PAMP），是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障[6]。</p><p>　　TLR2的配體較TLR4的廣泛，包括脂蛋白，脂多肽，脂壁酸(LTA)阿拉伯甘聚糖(LAM)及酵母多糖等[8]。</p><p>　　TLR5可以識別鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的TLR5的惟一配體。具有鞭毛蛋白的L型細(xì)菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和鼠傷寒沙門菌等可被TLR5識別。&l

20、t;/p><p>　　TLR3特異識別病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物ds-RNA，從而激活NF-kB和干擾素IFN-β前體。Doyle S E等證實(shí)，抗TLR3單克隆抗體能抑制成纖維細(xì)胞IFN-β的產(chǎn)生。Christopher A等證實(shí)TLR3還具有調(diào)控鼻病毒對人支氣管細(xì)胞感染的能力，這也說明了TLR3在宿主抵抗活病毒中發(fā)揮重要的作用[7]。</p><p>　　TLR7識別咪喹啉家族低分子量的咪唑莫特、

21、R-848和R-847等。</p><p>　　TLR7、TLR8和TLR9高度同源，與其他TLR不同，它們在細(xì)胞內(nèi)涵體中起作用，吞噬和包膜溶解后結(jié)合它們的配體。</p><p>　　TLR9識別細(xì)菌的CpG-DNA，激活B細(xì)胞和APC的免疫刺激特性。</p><p>　　另外，TLR對配體的識別，不同類型的TLRs可以組合，從而識別不同的PMAPs，如TLR1與T

22、LR6可以協(xié)同TLR2對不同的PMAPs分子進(jìn)行組合識別；TLR7可能同TLR9組合來介導(dǎo)CpG激活免疫細(xì)胞。其中TLR4、TLR4和TLR9、TLR9是以同源二聚體的形式進(jìn)行；而TLR2、TLR4、TLR2、TLR6和TLR7、TLR8為異源二聚體，還有的二聚體中有一個(gè)亞單位尚未確定，如TLR3、TLR、TLR5、TLR[9]。如圖：</p><p>　　圖2 各類Toll樣受體的功能</p>&

23、lt;p>　　Toll樣受體在獲得性免疫中同樣具有識別作用，并且Toll樣受體對獲得性免疫應(yīng)答類型還具有調(diào)控作用。多數(shù)TLRs活化后可以誘導(dǎo)抗微生物防御系統(tǒng)，產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF以及趨化型細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)機(jī)體Th1和Th2兩種方面的平衡[9]。</p><p>　　1.1.3 Toll樣受體的對配體的識別</p><p>　　TLR識別配體：TLR是結(jié)合病原微生物成分的

24、受體，其配體包括合成的激動(dòng)藥、微生物產(chǎn)物、內(nèi)源性配體其所識別的病原微生物成分包括脂多糖(lipoPolysaeeharide，LpS)、革蘭氏陽性細(xì)菌的膚聚糖(peptidoglyean，pGN)、脂磷壁酸(liPoteiehoieaeid，LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖(11-poarabinomannan，LAM)等。TLR4可以識別革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)，還可識別宿主壞死細(xì)胞釋放的熱休克蛋白(heat-shockproteins

25、，HSP)，體內(nèi)類肝素硫酸鹽和透明質(zhì)酸鹽降解的多糖部分以及局部的內(nèi)源性酶的級聯(lián)活化反應(yīng)也可激活TLR4。TLR胞外段為富含亮氨酸重復(fù)序列，參與配體識別；胞內(nèi)段含有保守的TIR(Toll樣/IL-IR)結(jié)構(gòu)域，招募銜接分子如MYD88、TIRAP、TRIF、TRAM進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。</p><p>　　1.2 哺乳類Toll樣受體的研究現(xiàn)狀</p><p>　　目前，根據(jù)人類和小鼠的研究情況，

26、已報(bào)道的TLRs有13種，其中人類包含10種，分別為TLRl-TLRl0，小鼠中包含TLR1-TLR9及TLRll、12、13，TLRll、12、13是小鼠中新發(fā)現(xiàn)的三種TLRs。人類基因組中存在TLRll的同源序列，但不能表達(dá)完整的TLRll(Zhang等人，2004)，目前還沒未發(fā)現(xiàn)人TLRl2和TLRl3的直向同源基因(Tabeta等人，2004)[2-4]。</p><p>　　兩個(gè)主要的TLR亞科確定在

27、人類中。TLR1，2，4，5，6和10號是細(xì)胞表面識別微生物油脂，糖和蛋白質(zhì)的亞科成員。TLR3，7，8和9號是在核酸檢測子群中識別病毒核酸衍生物或者細(xì)菌來源。核酸的TLRs定位在各種細(xì)胞內(nèi)的間隔[8]。三種在小鼠中被發(fā)現(xiàn)TLR基因，TLR11，12，和13號，已經(jīng)從人類基因組中丟失，并且這三種，只有TLR11的一個(gè)配體被確認(rèn)到目前。這種配體就是Pro?lin，一種原生動(dòng)物寄生蟲中的蛋白質(zhì)，表明了TLR11也是一種細(xì)胞表面受體。<

28、/p><p>　　TLR1，2，6和10號基因從一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的集群基于序列相似性和基因組結(jié)構(gòu)，并且在它們的二聚體組合它們覆蓋了細(xì)菌肽聚糖和脂蛋白廣泛的變化[4,5]。它們基本上分布在細(xì)胞表面還有通過招募IL-1R受體分子激活它們誘導(dǎo)NF-B的表達(dá)。</p><p>　　在哺乳動(dòng)物中，TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭分子已經(jīng)被鑒定出的有四種，分別是：MyD88、Mal(MyD88 adaptor-l

29、ike protein)、TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-B)和TRAM(TRIF-related adaptor molecule)[5]。</p><p>　　TLRs識別它們的配體通過與LRRs的互動(dòng)并且觸發(fā)激活細(xì)胞內(nèi)信號通過一個(gè)細(xì)胞質(zhì)的髓樣分化初級反應(yīng)蛋白88（MyD88）依賴路徑或者一個(gè)MyD88獨(dú)立路徑。所有哺乳動(dòng)物的TLRs，除了TLR

30、3，依靠至少一部分MyD88適配器的完整的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)。在MyD88依賴性途徑中，MyD88招募白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAKs）和腫瘤壞死因子受體因子6（TRAF6，這反過來激活下游基因在TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中[5]。最終，通過激活NF-B，IRF3，或者IRF7，TLR信號通路誘導(dǎo)生產(chǎn)免疫炎性因子包括白細(xì)胞介素（IL），腫瘤壞死因子（TNF），和I型干擾素（IFN）分子調(diào)節(jié)直接免疫反應(yīng)和提醒適應(yīng)性免疫細(xì)胞病原體的存在。近年來的TLR信

31、號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)在哺乳動(dòng)物中被深入研究。發(fā)現(xiàn)幾個(gè)TIR適配器導(dǎo)致最近的理解是不同的TLR類型招募不同的細(xì)胞適配器，可以觸發(fā)特定的反應(yīng)為感染的微生物。此外，細(xì)胞類型的特異性信號定義其免疫學(xué)特性可以改變響應(yīng)觸發(fā)同樣的TLR信號在不同的細(xì)胞類型里。</p><p>　　1.3 魚類Toll樣受體的研究現(xiàn)狀</p><p>　　近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，Toll受體的研究和應(yīng)用進(jìn)入

32、了一個(gè)迅速發(fā)展的新階段。魚類被認(rèn)為有一種原始的免疫系統(tǒng)，有著巨大的科研價(jià)值在比較它們與哺乳動(dòng)物的的防御機(jī)制和自適應(yīng)性。它們代表了大約一半的脊椎動(dòng)物，因此形成了最大及最多樣的脊椎動(dòng)物組。在脊椎動(dòng)物中，TLRs可以區(qū)分類病原體并且在編排適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性免疫反應(yīng)起著一個(gè)重要的作用。TLRs包括一個(gè)富含氨基酸的重復(fù)序列區(qū)（LRR）的胞外N-末端，一個(gè)跨膜域和一個(gè)包含一個(gè)Toll-IL-1受體域(TIR)的胞內(nèi)C-末端。細(xì)胞質(zhì)上的TIR域的港口保存氨

33、基酸已經(jīng)被證實(shí)參與傳訊以及TLR的坐落，而LRR區(qū)域參與病原體識別。</p><p>　　其中，魚源Toll樣受體的研究也取得了明顯進(jìn)展。在過去的十年中出現(xiàn)對五種魚種的的基因組研究和起草基因組序列導(dǎo)致了至少16種TLR類型的發(fā)現(xiàn)[7]。魚類TLRs的主要特點(diǎn)和在它們信號級聯(lián)反應(yīng)的相關(guān)因素和哺乳動(dòng)物的TLR系統(tǒng)具有很高的結(jié)構(gòu)相似性。</p><p>　　基因組和基因重復(fù)成為了魚類豐富進(jìn)化歷史

34、和基因組多樣性的主要的貢獻(xiàn)者，這在魚類生物學(xué)家們在研究時(shí)使用基因組學(xué)工具常常被忽視。2R基因組的復(fù)制傳說，指出了兩輪在脊椎動(dòng)物祖先里的基因重復(fù)，這個(gè)立刻和鰻系的分歧相差了500-800百萬年[4,6,7]。第二個(gè)四倍體時(shí)間可能發(fā)生在脊椎動(dòng)物亞門，正好與頜骨的發(fā)展一致。這些現(xiàn)象的證據(jù)可以再某些基因家族中看到。文昌魚（頭索動(dòng)物）有一個(gè)單盒的基因簇，而七鰓鰻（脊椎動(dòng)物）裝備了兩個(gè)獨(dú)立群。分析表明，骨類魚基因組Hox集群和許多其他基因位點(diǎn)呈現(xiàn)出

35、一個(gè)更高的復(fù)制號碼比起哺乳動(dòng)物，這為一個(gè)古老的全因組復(fù)制在硬骨魚系從它從葉翅片血統(tǒng)中分裂在325-350MYA提供了了證據(jù)[8]。</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)，魚類TLRs不僅具有哺乳類所有TLR種類的同源基因，而且還具有一些目前在哺乳類未發(fā)現(xiàn)的TLR種類，據(jù)推測這些TLR種類在哺乳類的進(jìn)化過程中已經(jīng)丟失[6]。其中，河豚基因組測序的成功完成促進(jìn)了魚類TLR的研究：2003年，Oshiumi等首先在河豚基因組中

36、尋找人類TLRs的同源序列，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)DNA區(qū)域可能代表魚類的TLRs。通過進(jìn)一步比對，確定其中6個(gè)基因與人類TLRs具有高度相似性，分別命名為FuguTLR2、FuguTLR3、FuguTLR5、FuguTLR7、FuguTLR8、FuguTLR9[7]；有一個(gè)基因編碼的氨基酸序列與人類TLR1、TLR6、TLR10高度同源，而人類TLR1、TLR6、TLR10屬于共同祖先進(jìn)化支系，因此命名為FuguTLR1。另外有2個(gè)基因與人類T

37、LRs同源性較低，在哺乳類其他物種也未見相近的TLRs EST或DNA序列，說明這兩種是魚類特有的TLRs，命名為FuguTLR2l和FuguTLR22[10]。但是，人類TLR4在河豚基因組中未發(fā)現(xiàn)同源序列，說明河豚可能缺少TLR4基因。RT-PCR結(jié)果表明所有FuguTLRs在多種不同組織中</p><p>　　迄今為止，雖然在不同魚類中克隆和鑒定出多種TLR，對其進(jìn)行初步分析并闡明了一些病原微生物成分通過T

38、LR將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的過程，但是大部分魚類TLR的功能及作用機(jī)制尚不清楚[12]。</p><p>　　魚類TLRs的研究目前還處于基因鑒定階段，因此對于各種TLRs的識別配基及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還需進(jìn)一步研究。特別要提到是，雖然魚類的TLRs多數(shù)與哺乳類同源，但也有一些在哺乳類基因組目前找不到同源基因、推測是魚類所特有的TLR種類，這些種類的存在可能與魚類的生存環(huán)境和面臨的各種壓力相關(guān)，因此研究魚類等低等脊椎動(dòng)物的

39、TLRs，探索它們在防御外界病原侵略的機(jī)制，對深人理解先天免疫的進(jìn)化歷程以及認(rèn)識哺乳類的免疫機(jī)制將有重要意義[8-10]。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 GenBank中魚源TLR-1及類似TLR</p>

40、<p>　　來源于斑馬魚（Danio rerio）中的Toll-like receptor 6（NP_001124065.1）。</p><p>　　來源于虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中的Toll-like receptor 1 protein-like protein（ACV92063.1），Toll-like receptor 6 precursor（NP_001159573.

41、1）。</p><p>　　來源于草鯉魚（Ctenopharyngodon idella）中的Toll-like receptor 1（ACT68332.1）。</p><p>　　來源于斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中的Toll-like receptor 1（AEI59662.1）。</p><p>　　來源于點(diǎn)帶石斑魚（Epinephel

42、us coioides）中的Toll-like receptor 1（AEB32452.1）。</p><p>　　來源于大西洋鮭魚（Salmo salar）中的Toll-like receptor 1（AEE38252.1）。</p><p>　　來源于紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）中的Toll-like receptor 1（ADX01348.1）。</p>

43、;<p>　　來源于紅鰭多紀(jì)鲀（Takifugu rubripes）中的Toll-like receptor 1（AAW69368.1）。</p><p>　　來源于哈羅孔雀魚（Tetraodon nigroviridis）中的Toll-like receptor 1（ABO15772.1），unnamed protein product（CAG06259.1）。</p><p&

44、gt;　　2.1.2 主要生物學(xué)分析軟件和在線蛋白質(zhì)分析工具</p><p>　　2.1.2.1 生物學(xué)分析軟件：</p><p>　　Vector NTI Suite 10.0，Clustal X 1.85，Mega 4.0，DNAman6.03，Cn3D。</p><p>　　2.1.2.2 在線蛋白分析網(wǎng)站包括：</p><p>　　美

45、國國立生物信息中心： http://www.ncbi.nlm.nih.gov</p><p>　　基本BLAST檢索： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast</p><p>　　蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)： http://www.expasy.org</p><p>　　蛋白質(zhì)結(jié)

46、構(gòu)域分析： http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM</p><p>　　蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)預(yù)測分析： http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html</p><p>　　蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器： http://www.predictprotein.org</p><p

47、>　　蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器： http://swissmodel.expasy.org</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 魚源TLR-1序列的檢索與整理</p><p>　　利用GenBank數(shù)據(jù)庫檢索魚源TLR-1（Toll-like receptor 1，TLR1）氨基酸序列

48、。操作如下：打開www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站，在Nucleotide欄目下，在搜索框中輸入TLR，F(xiàn)ISH，然后點(diǎn)擊Search，得到搜索結(jié)果。仔細(xì)分辨物種來源，以Fasta格式整理不同魚類來源的TLR的蛋白質(zhì)序列。</p><p>　　2.2.2 序列比對及部分蛋白的基本生化特性分析</p><p>　　2.2.2.1 序列比對</p><p>　

49、　借助Vector NTI 10.0軟件對上述氨基酸序列進(jìn)行序列比對。</p><p>　　2.2.2.2 部分蛋白的基本生化特性分析</p><p>　　借助Vector NTI 10.0軟件對TLR基本生化特性進(jìn)行分析。</p><p>　　2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　　借助Mega 4.0軟件對上述不同魚源的Toll樣受

50、體的氨基酸做系統(tǒng)關(guān)系分析，自展檢驗(yàn)為1000，構(gòu)建NJ樹。</p><p>　　2.2.4 魚源TLR-1受體二級結(jié)構(gòu)模擬比較分析</p><p>　　借助The Predict Protein Server，選擇3個(gè)不同來源的魚源TLR-1受體氨基酸序列（Ci-tlr-1，Ip-tlr-1，Tr-tlr-1）做二級結(jié)構(gòu)模擬。操作如下：打開http://cubic.bioc.columbi

51、a.edu/predictprotein，輸入氨基酸序列，如下圖所示：</p><p>　　圖3 Ci-tlr-1二級結(jié)構(gòu)模擬過程</p><p>　　2.2.5 魚源TLR-1受體三級結(jié)構(gòu)模擬比較分析</p><p>　　選取了3種有代表性的魚源TLR-1氨基酸序列（Ci-tlr-1，Ip-tlr-1，Tr-tlr-1），借助Swiss-Model服務(wù)器對3種魚源

52、TLR-1受體氨基酸序列做三級結(jié)構(gòu)模擬。操作如下：</p><p>　?。?）打開http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html</p><p>　　圖4 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模擬網(wǎng)站圖標(biāo)</p><p>　　（2）點(diǎn)擊“Automated Mode”，輸入所需模擬的氨基酸序列，如下所示：</p><p&g

53、t;　　圖5 Ip-tlr-1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模擬過程</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 部分不同魚源TLR-1受體氨基酸序列比對</p><p>　　圖6 部分不同魚源TLR-1受體氨基酸序列比對圖</p><p>　　序列比對中的進(jìn)化假設(shè)：所有的生物都起源于同一個(gè)祖先；序列

54、不是隨機(jī)產(chǎn)生，而是在進(jìn)化上，不斷發(fā)生著演變。</p><p>　　序列比對的原因：（1）不同物種中，許多基因的功能保守，序列相似性較高，通過多條序列的比較，發(fā)現(xiàn)保守與變異的部分。（2）通過將兩個(gè)或多個(gè)核酸序列或蛋白序列進(jìn)行比對，顯示其中相似的結(jié)構(gòu)域，這是進(jìn)一步相似性分析的基礎(chǔ)。通過比較未知序列與已知序列的一致性或相似性，可以預(yù)測未知序列功能。（3）構(gòu)建進(jìn)化的樹的必須步驟（4）比較基因組學(xué)研究。（5）同源物鑒定的功

55、能預(yù)測。</p><p>　?。?）蛋白質(zhì)序列的保守性決定于其編碼DNA的保守性。</p><p>　　如圖所示：本文通過對不同魚類的TLR-1之間的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)不同魚類的TLR-1之間的氨基酸序列相當(dāng)保守，具有很高的同源性。染色部分的氨基酸序列是相同或者相似的，大致發(fā)現(xiàn)，這幾種魚類TLR-1的氨基酸序列相似度高達(dá)80％以上。其實(shí)，340-450，520-650氨基酸片

56、段，是他們的L（亮氨酸）富集區(qū)，基本都處于胞膜外區(qū)。TLR胞膜外區(qū)為有17個(gè)～31個(gè)亮氨酸富集的重復(fù)序列(Leucine rich repeats，LRRs)，并且都含有3個(gè)胞外段輔助蛋白即MD-1、MD-2和RP105，參與對疾病相關(guān)分子模式（PAMP）的識別。</p><p>　　3.2 部分魚源TLR-1受體氨基酸基本生化特性分析</p><p>　　表1 部分TLR-1氨基酸基本特

57、性</p><p>　　從表1中可得：不同魚源的TLR-1之間，各級基本特性基本相同。其中，我們可以發(fā)現(xiàn)，不同魚源的TLR-1的分子量都十分巨大，并且相當(dāng)接近。同是，從圖上可以看出，它們的等電點(diǎn)也比較接近，這是由于它們之間的酸性氨基酸和堿性氨基酸的個(gè)數(shù)接近。蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)，同是我們可以看出，如果堿性氨基酸總和大

58、于酸性氨基酸，這種TLR-1的等電點(diǎn)就成堿性，反之，酸性氨基酸大于堿性氨基酸，則等電點(diǎn)為酸性。結(jié)合圖6，我們可以大致的推測出各種魚源TLR-1之間的結(jié)構(gòu)與功能之間的相似程度。</p><p>　　3.3 11種不同魚源TLR-1受體系統(tǒng)關(guān)系比較</p><p>　　圖7 各種TLR-1受體進(jìn)化樹</p><p>　　進(jìn)化樹分析判定幾者之間是否具有同源性，親緣相似性的

59、遠(yuǎn)近。分析系統(tǒng)進(jìn)化樹圖，可以知道不同物種，Tn（哈羅孔雀魚）和Tr（紅鰭多紀(jì)鲀）；Ec(點(diǎn)帶石斑魚)和Ls（紅笛鯛）；Ss（大西洋鮭魚）和Om（虹鱒）；Ci（草魚）和Dr（斑馬魚）之間的同源性很高，其中Ls和Ec的同源可靠性只有88％。同時(shí)，Ip（斑點(diǎn)叉尾鮰）與Dr還有Ci的同源性也相對接近。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中，我們還可以看到，Tn-TLR-X與Tn-TLR-1的同源性基本一致，而Tn-TLR-X是最近被人們發(fā)現(xiàn)，還未命名的一種TLR，由此

60、，我們可以大膽的推測，Tn-TLR-X的結(jié)構(gòu)與功能也與Tn-TLR-1基本相似，可以Tn-TLR-X歸類到Tn-TLR-1中，或者以它們可能同源為方向，為研究Tn-TLR-X的功能性質(zhì)提供線索。</p><p>　　3.4 部分魚源Toll樣受體二級結(jié)構(gòu)</p><p><b>　　>Ip-tlr-1</b></p><p>　　圖8 I

61、p-tlr-1二級結(jié)構(gòu)圖</p><p><b>　　>Ci-tlr-1</b></p><p>　　圖9 Ci-tlr-1二級結(jié)構(gòu)圖</p><p><b>　　>Tr-tlr-1</b></p><p>　　圖10 Tr-tlr-1二級結(jié)構(gòu)圖</p><p>

62、　　蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)都可以用于多序列對比。這種比對在加入有關(guān)的二級結(jié)構(gòu)資料后，可以變的更加準(zhǔn)確。一些不能對比一級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)也可以找出它們的關(guān)系來。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是內(nèi)部折疊、內(nèi)部殘基距離預(yù)測的基礎(chǔ)。更進(jìn)一步，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可以作為其它工作的基礎(chǔ)。例如，用于推測蛋白質(zhì)的功能，預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)等。α螺旋是蛋白質(zhì)中常見的一種二級結(jié)構(gòu)，肽鏈主鏈繞假想的中心軸盤繞成螺旋狀，一般都是右手螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋是靠鏈內(nèi)氫鍵維持的。每個(gè)氨基酸殘基（第n

63、個(gè)）的羰基氧與多肽鏈C端方向的第4個(gè)殘基（第n+4個(gè)）的酰胺氮形成氫鍵。在典型的右手α-螺旋結(jié)構(gòu)中，螺距為0.54nm，每一圈含有3.6個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)殘基沿著螺旋的長軸上升0.15nm。β折疊是蛋白質(zhì)中的常見的二級結(jié)構(gòu)，是由伸展的多肽鏈組成的。折疊片的構(gòu)象是通過一個(gè)肽鍵的羰基氧和位于同一個(gè)肽鏈或相鄰肽鏈的另一個(gè)酰胺氫之間形成的氫鍵維持的。氫鍵幾乎都垂直伸展的肽鏈，這些肽鏈可以是平行排列（走向都是由N到C方向）；或者是反平行排列（肽鏈

64、反向排列）。對這三個(gè)典型的不同魚源TLR-1二級結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)它們的二級結(jié)構(gòu)基本相同，都具有α螺旋和β折疊，且它們</p><p>　　3.5 部分魚源TLR-1三級結(jié)構(gòu)</p><p><b>　　>Ip-tlr-1</b></p><p>　　圖11 Ip-tlr-1三級結(jié)構(gòu)圖</p><p><

65、;b>　　>Ci-tlr-1</b></p><p>　　圖12 Ci-tlr-1三級結(jié)構(gòu)圖</p><p><b>　　>Tr-tlr-1</b></p><p>　　圖13 Tr-tlr-1三級結(jié)構(gòu)圖</p><p>　　三級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上借助各種次級鍵卷曲折疊成特定的球狀

66、分子結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象。觀察三個(gè)不同魚源的三級結(jié)構(gòu)圖，可知，同型號的TLR-1的空間結(jié)構(gòu)基本相似。三種不同魚源的TLR-1的α螺旋和β折疊的個(gè)數(shù)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的相差無幾，且它們本身相對比，個(gè)數(shù)也相近。從圖中可知TLRs的空間構(gòu)象基本是由α螺旋和β折疊交替形成的穩(wěn)定的彎曲螺線管狀結(jié)構(gòu)，彎曲的結(jié)構(gòu)能夠保證其自由能降低從而保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，螺線管狀結(jié)構(gòu)為分子提供了一個(gè)良好的疏水中心，它的凹面是LRR配體結(jié)合區(qū)，親水性殘基往往與疏水性殘基交替出現(xiàn)，這

67、對于穩(wěn)定TLR的空間構(gòu)象有重要作用。LRR結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)模式非常合適。它們在空間結(jié)構(gòu)上形成的蹄形的“凹陷表面”配體結(jié)合區(qū)域被認(rèn)為是連接綁定位點(diǎn)，其能與抗原形成穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)，正是這種緊密的結(jié)合促使模式識別受體更好地發(fā)揮識別病原體并啟動(dòng)天然免疫的過程。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　魚類TLRs的主要特點(diǎn)還有在它們

68、信號級聯(lián)反應(yīng)的因素和哺乳動(dòng)物的TLR系統(tǒng)有很高的相似性。然而魚類TLRs也表現(xiàn)出了非常獨(dú)特的功能和大量的多樣性，可能是它們不同的進(jìn)化歷史和它們占據(jù)的不同環(huán)境造成的[17]。同時(shí)出項(xiàng)的基因組研究技術(shù)即應(yīng)導(dǎo)致了不同的魚類TLRs的發(fā)現(xiàn)，這探索的實(shí)際作用對每個(gè)TLR在每個(gè)不同的物種或者一組相關(guān)的物種中才剛剛開始。在至少16種TLR類型在魚類中被識別的，直接證明了配體的特異性只在TLR22，TLR3TLR5M,TLR5S和TLR22中出現(xiàn)[18

69、]。</p><p>　　TLRs是一組與天然免疫密切相關(guān)的受體家族，在天然免疫防御中起著重要作用，并能激活獲得性免疫系統(tǒng)[13]。迄今為止，雖然在不同魚類中克隆和鑒定出多種TLR，對其進(jìn)行初步分析并闡明了一些病原微生物成分通過TLR將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的過程，但是大部分魚類TLR的功能及作用機(jī)制尚不清楚[14]。</p><p>　　本文通過對魚源TLRs蛋白空間結(jié)構(gòu)的模擬，得出TLRs的

70、空間構(gòu)象基本是由α螺旋和β折疊交替形成的穩(wěn)定的彎曲螺線管狀結(jié)構(gòu)[15]，彎曲的結(jié)構(gòu)能夠保證其自由能降低從而保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，螺線管狀結(jié)構(gòu)為分子提供了一個(gè)良好的疏水中心，它的凹面是LRR配體結(jié)合區(qū)，親水性殘基往往與疏水性殘基交替出現(xiàn)，這對于穩(wěn)定TLR的空間構(gòu)象有重要作用[16-18]。LRR結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)模式非常合適。它們在空間結(jié)構(gòu)上形成的蹄形的“凹陷表面[19]”配體結(jié)合區(qū)域被認(rèn)為是連接綁定位點(diǎn)，其能與抗原形成穩(wěn)定的二聚

71、體結(jié)構(gòu)，正是這種緊密的結(jié)合促使模式識別受體更好地發(fā)揮識別病原體并啟動(dòng)天然免疫的過程[20]。</p><p>　　隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和研究工作的全面開展，魚類Toll樣受體家族的研究必將取得更加深入的進(jìn)展，并能為研究抗病毒感染、病毒逃逸機(jī)制、病原微生物與宿主免疫之間的相互作用以及某些疾病防治等提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b>&

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82、cadSciUS A, 2001, 98(16): 9237-9242.</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　本研究及學(xué)位論文是在我的導(dǎo)師賈副教授的親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)下完成的。他嚴(yán)肅的科學(xué)態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神，精益求精的工作作風(fēng)，深深地感染和激勵(lì)著我。從課題的選擇到項(xiàng)目的最終完成，賈老師都始終給予我細(xì)心的指導(dǎo)和不懈的支持。半年多來，賈永