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1、脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞、組織的生物學(xué)效應(yīng)越來(lái)越受到重視。低強(qiáng)度電脈沖導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔,以此為依據(jù)的電化學(xué)療法和電基因轉(zhuǎn)染技術(shù)為腫瘤治療帶來(lái)希望;高強(qiáng)度電脈沖作用于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),引起線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化,細(xì)胞發(fā)生凋亡,這為惡性腫瘤殘余病灶的治療帶來(lái)希望。本實(shí)驗(yàn)組既往發(fā)現(xiàn):能量可控電脈沖產(chǎn)生的高強(qiáng)度電場(chǎng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,腫瘤組織生長(zhǎng)受限、侵襲能力抑制,荷瘤動(dòng)物的生存期延長(zhǎng)。線(xiàn)粒體為能量供應(yīng)場(chǎng)地,也是凋亡發(fā)生的重要結(jié)構(gòu),凋亡信號(hào)刺激線(xiàn)粒體膜通透性增加,線(xiàn)
2、粒體膜孔道(PTP)開(kāi)放,釋放如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等凋亡蛋白,凋亡相關(guān)信號(hào)通道的激活,導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)以卵巢癌移植瘤為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)三部分的研究,分析出電脈沖誘導(dǎo)卵巢癌線(xiàn)粒體變化的最佳劑量學(xué)水平,并對(duì)線(xiàn)粒體中相關(guān)凋亡蛋白及其凋亡信號(hào)通道上相關(guān)因子變化的檢測(cè),分析線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化,證實(shí)高強(qiáng)度電脈沖誘導(dǎo)卵巢癌凋亡的線(xiàn)粒體機(jī)制。 第一部分能量可控電脈沖影響卵巢癌線(xiàn)粒體膜的劑量學(xué)研究 目的:通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)
3、粒體膜PTP孔道的改變,分析對(duì)線(xiàn)粒體膜影響最大的脈沖參數(shù)組合,研究電脈沖對(duì)線(xiàn)粒體的作用的劑量學(xué)基礎(chǔ),求證此參數(shù)組合電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,為脈沖引起的線(xiàn)粒體凋亡的研究奠定劑量學(xué)依據(jù)。 材料與方法:以卵巢癌裸鼠皮下移植瘤為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)脈沖電場(chǎng)四因素三水平,脈沖電場(chǎng)作用于各實(shí)驗(yàn)組卵巢癌移植瘤,共聚焦顯微鏡檢測(cè)羅丹明123(Rh123)的染色程度分析電脈沖對(duì)線(xiàn)粒體膜PTP的變化,運(yùn)用最佳參數(shù)組合的脈沖電場(chǎng)作用于卵
4、巢癌組織,RT-PCR測(cè)定Bcl-2 mRNA的變化。 結(jié)果:在電脈沖參數(shù)中,電壓、頻率、脈寬顯著影響線(xiàn)粒體膜PTP的開(kāi)放,作用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)其無(wú)明顯影響(P>0.05);當(dāng)電壓為1000V、脈寬為250ns、頻率為1000Hz時(shí),細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強(qiáng)度最強(qiáng),脈沖電場(chǎng)對(duì)線(xiàn)粒體膜PTP影響最顯著。在此電場(chǎng)參數(shù)作用下,卵巢癌移植瘤Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下降。 結(jié)論:不同參數(shù)組合的電脈沖對(duì)線(xiàn)粒體膜有不同強(qiáng)度的作用。高電壓
5、、高頻率可使線(xiàn)粒體膜PTP最大程度開(kāi)放。然而并非脈寬越低,對(duì)線(xiàn)粒體膜PTP的影響越大;當(dāng)脈寬達(dá)到一定范圍內(nèi),出現(xiàn)對(duì)線(xiàn)粒體膜最大程度的效應(yīng)。利用分析出的最大參數(shù)組合脈沖作用于卵巢癌,可降低凋亡相關(guān)基因Bcl-2 mRNA的表達(dá),提示電脈沖可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體凋亡的發(fā)生,為脈沖的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分高強(qiáng)度電脈沖促卵巢癌線(xiàn)粒體凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 目的:證實(shí)高電壓、高頻率電脈沖可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡與影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如線(xiàn)粒體是否有必然的聯(lián)系
6、,研究高強(qiáng)度電脈沖是否影響了線(xiàn)粒體凋亡的途徑。 材料與方法:人卵巢癌囊腺癌(SKOV3)接種于裸鼠皮下建立腫瘤模型,數(shù)字隨機(jī)法分為實(shí)驗(yàn)組1-4和對(duì)照組,采用第一部分所得結(jié)果的高強(qiáng)度電脈沖作用于卵巢癌移植瘤。即刻行光電鏡觀(guān)察,與對(duì)照組對(duì)比分析細(xì)胞膜、細(xì)胞器及其內(nèi)容物、細(xì)胞核的改變。于脈沖作用后0h、6h、12h、24h取材,羅丹明123(Rh123)標(biāo)記卵巢癌組織內(nèi)線(xiàn)粒體膜,激光共聚焦測(cè)定線(xiàn)粒體PTP的變化;免疫組化和免疫熒光法檢
7、測(cè)細(xì)胞色素C(Cyt C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果:高強(qiáng)度電脈沖處理后,細(xì)胞形態(tài)保持完整,線(xiàn)粒體數(shù)量增加,細(xì)胞核膜破裂、異染色質(zhì)增多,凋亡小體增加。線(xiàn)粒體外膜通透性增加,PTP開(kāi)放;高強(qiáng)度電脈沖作用后0h,AIF表達(dá)顯著增加,隨時(shí)間其強(qiáng)度有所降低,當(dāng)脈沖作用后12-24小時(shí),細(xì)胞內(nèi)表達(dá)持續(xù)存在,其熒光強(qiáng)度值為別為86.15±2.05%、70.45±1.92%、62.35±2.56%、50.67±1.87%,較對(duì)
8、照組顯著升高;脈沖作用后0h,Cyt C表達(dá)高達(dá)89.05±2.35%;6h-12h后,表達(dá)的水平稍微降低,其熒光強(qiáng)度值為76.48±1.93%及57.62±2.08%,24h小時(shí)后表達(dá)細(xì)胞減少,其值為41.72±2.30%,仍高于對(duì)照組。 結(jié)論:高強(qiáng)度電脈沖作用后,卵巢癌細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體的數(shù)量和功能發(fā)生改變,線(xiàn)粒體相關(guān)的凋亡蛋白釋放入細(xì)胞質(zhì),誘導(dǎo)凋亡。線(xiàn)粒體凋亡途徑被激活,并能在脈沖處理后6-12小時(shí)持續(xù)發(fā)揮作用,提示高強(qiáng)度電脈沖
9、對(duì)凋亡信號(hào)途徑的調(diào)控作用,通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體凋亡功能的影響抑制卵巢癌的生長(zhǎng)與增殖,為高強(qiáng)度電脈沖治療腫瘤殘留提供了可能。 第三部分高強(qiáng)度電脈沖對(duì)線(xiàn)粒體凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)的影響 目的:通過(guò)對(duì)調(diào)控線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路上相關(guān)分子的檢測(cè),分析高強(qiáng)度電脈沖誘導(dǎo)卵巢癌凋亡的可能線(xiàn)粒體途徑,明確高強(qiáng)度電脈沖產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)與線(xiàn)粒體改變的相關(guān)性。 材料與方法:人卵巢癌囊腺癌(SKOV3)接種于裸鼠皮下建立腫瘤模型,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1-4和對(duì)照組
10、,高強(qiáng)度電脈沖參數(shù)為第一部分實(shí)驗(yàn)所得,作用于實(shí)驗(yàn)組卵巢癌移植瘤。于脈沖處理后0h、6h、12h、24h取出標(biāo)本。免疫熒光法檢測(cè)電壓依賴(lài)陰離子通道(VDAC)的變化,F(xiàn)luo-3/AM探針標(biāo)記后激光共聚焦定位細(xì)胞內(nèi)外Ca2+分布,熒光分光光度計(jì)測(cè)量Ca2+含量變化,RT-PCR測(cè)定bcl-2、bax的mRNA水平。與對(duì)照組比較其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果:高強(qiáng)度電脈沖作用0h后,實(shí)驗(yàn)組卵巢癌細(xì)胞VDAC表達(dá)顯著下降至17.99±1.15,
11、與對(duì)照組46.14±1.55比較,差異顯著;Ca2+向線(xiàn)粒體聚積,其含量明顯增加,達(dá)16.50±1.08,與對(duì)照組6.40±1.51比較,有顯著性差異。VDAC表達(dá)呈下降趨勢(shì),于脈沖作用后6h、12h、24h,熒光強(qiáng)度分別為5.85±1.19、6.10±1.31、3.80±0.53.Ca2+含量在脈沖作用后6h,亦呈下降趨勢(shì),12h后,其含量低于對(duì)照組,24h后Ca2+在線(xiàn)粒體內(nèi)聚積趨于消失。bcl-2在高強(qiáng)度電脈沖作用后mRNA顯著下
12、調(diào),其相對(duì)灰度值為0.15,而對(duì)照組mRNA的灰度值維持于0.48,脈沖處理后bax表達(dá)增加,其灰度相對(duì)值為0.69,而維持于脈沖處理后24h內(nèi),同對(duì)照組比較,有顯著性差異。 結(jié)論:高強(qiáng)度電陡脈沖作為一種強(qiáng)的外昴刺激信號(hào),作用于線(xiàn)粒體外膜VDAC,使線(xiàn)粒體通透性下降,信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),第二信號(hào)Ca2+的分布和含量發(fā)生改變,細(xì)胞內(nèi)鈣超載,同時(shí)bcl-2的表達(dá)下降,bax表達(dá)增加,Bcl-2家族凋亡基因的表達(dá)波動(dòng),增強(qiáng)了凋亡信號(hào)在細(xì)胞
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