EZH2抗卵巢癌失巢凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EZH2可促進(jìn)卵巢癌的腹腔種植，但機(jī)制不明。本研究旨在探究卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)的EZH2抗失巢凋亡的作用。
　　方法：
　　1.建立失巢凋亡模型：用poly-HEMA包被的培養(yǎng)板建立卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的失巢凋亡模型，觀察懸浮培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的形態(tài)變化；
　　2.卵巢癌失巢凋亡模型的鑒定：Annexin V-FITC/PI檢測(cè)懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)(0h

2、/12h/24h/48h/72h/96h)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3及A2780的凋亡改變；
　　3.卵巢癌細(xì)胞失巢狀態(tài)下生物學(xué)特性的變化：分別通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3和A2780細(xì)胞懸浮培養(yǎng)48h后遷移能力和增殖能力的變化；
　　4.卵巢癌細(xì)胞失巢狀態(tài)下EZH2表達(dá)的變化：Western-blot技術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)(0H/12H/24H/48

3、H/72H/96H)的EZH2表達(dá)水平；
　　5.慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)EZH2后對(duì)失巢凋亡的影響：利用慢病毒轉(zhuǎn)染EZH2短發(fā)夾RNA（shRNA）沉默EZH2的表達(dá)，用嘌呤霉素篩選單克隆抗體，建立EZH2低表達(dá)的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)株（SKOV3 shEZH2）和其相對(duì)應(yīng)的對(duì)照空載體細(xì)胞（SKOV3 shNC）,用western-blot檢測(cè)SKOV3的轉(zhuǎn)染效率；SKOV3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株SKOV3 shEZH2及其對(duì)照組SKOV3 shNC懸浮培

4、養(yǎng)48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，比較其凋亡率的變化；
　　6.藥物對(duì)失巢凋亡的影響：用特異性EZH2抑制劑Dznep、GSK126作用于卵巢癌細(xì)胞SKOV3，DMSO為對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)懸浮培養(yǎng)48h后不同處理組的卵巢癌細(xì)胞的凋亡率；
　　7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)EZH2對(duì)凋亡的影響：取本實(shí)驗(yàn)組前期建立的SKOV3 shEZH2和SKOV3 shNC裸鼠腹腔種植瘤模型的瘤體標(biāo)本切片后TUNEL法檢測(cè)凋亡的表達(dá)；免疫組化檢測(cè)各

5、標(biāo)本中EZH2，Ki67，cleaved-caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. SKOV3細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈不規(guī)則多角形，A2780細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。懸浮培養(yǎng)后SKOV3和A2780細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積變小，回縮為球形，48h后SKOV3可形成大而疏散的細(xì)胞團(tuán)，而A2780細(xì)胞則形成小而致密的細(xì)胞球。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞SKOV3在懸浮培養(yǎng)48h后細(xì)胞凋亡進(jìn)入穩(wěn)態(tài)，而A2780細(xì)胞的凋亡

6、率呈時(shí)間依賴性增高。
　　3.與貼壁細(xì)胞相比懸浮培養(yǎng)48h后重貼壁SKOV3和A2780細(xì)胞的增殖能力未見(jiàn)明顯改變（P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；SKOV3遷移能力明顯增強(qiáng)（P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），而A2780細(xì)胞遷移能力未見(jiàn)明顯變化（P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；
　　4.Western-blot結(jié)果顯示：卵巢癌細(xì)胞SKOV3隨懸浮培養(yǎng)時(shí)間的增加EZH2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，至48h后EZH2的表達(dá)趨于穩(wěn)定，

7、而卵巢癌細(xì)胞A2780隨懸浮培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，EZH2的表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變；
　　5.SKOV3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)48h后，與對(duì)照組DMSO相比，EZH2抑制劑DZNEP（1μg/ml）和GSK126（1μg/ml）處理組細(xì)胞凋亡增多；同時(shí)SKOV3 shEZH2在懸浮培養(yǎng)48h后的凋亡與對(duì)照組SKOV3 shNC相比明顯增高；
　　6.裸鼠腹腔種植后瘤體免疫組化及TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與SKOV3 shNC組相比，SKOV3