光周期相關(guān)基因在大豆成花誘導與開花逆轉(zhuǎn)中的表達.pdf

1、大豆是典型的短日植物，在光周期反應(yīng)的早期研究中被當作模式植物。與水稻、玉米等短日植物相比，大豆的光周期反應(yīng)更加敏感，品種間的差異更大，單個品種的適應(yīng)性狹窄一直阻礙著大豆育種工作的開展。對于光周期反應(yīng)敏感的晚熟大豆品種來說，短日照不僅是成花誘導的必要條件，而且影響開花、結(jié)莢和鼓粒。一旦光周期條件不適，這些品種的生殖生長就會延遲，共至可從生殖生長狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到營養(yǎng)生長狀態(tài)。對大豆光周期反應(yīng)機制的研究將為培育廣適應(yīng)的大豆晶種奠定基礎(chǔ)。本研究利用R

2、ACE技術(shù)克隆了四個大豆光周期反應(yīng)的相關(guān)基因，并通過同源比對搜索到七個相關(guān)的光周期反應(yīng)基因，利用本實驗室長期以來建立的短日照(開花)、長日照(持續(xù)營養(yǎng)生長)、短日照一長日照(開花逆轉(zhuǎn))三位一體的實驗系統(tǒng)，采用Real-lime PCR技術(shù)研究了這11個基因在大豆成花誘導與開花逆轉(zhuǎn)中的表達，并比較了它們在光周期敏感性不同品種中的差異。為了進一步驗證與大豆光周期相關(guān)的GmSOC1基因的功能，本研究建立了利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導的豆科植物百脈根高效

3、快速的轉(zhuǎn)化平臺，并將該基因轉(zhuǎn)入百脈根中驗證了其功能。具體研究結(jié)果如下： 1.克隆了四個大豆光周期反應(yīng)的相關(guān)基因GmCOL1、GmCOL2、GmCOL3以及GmSOC1，它們分別編碼含311，365，310和211個氨基酸的蛋白。同源比對結(jié)果顯示，GmCOL1，GmCOL2， GmCOL3與豆科植物苜蓿和豌豆的CO-like基因的同源性最高；GmSOC1與擬南芥AGL20的同源性最高，達到70％，是MADS-box基因家族的一員。

4、 2.利用Real-Time PCR技術(shù)，通過對10個內(nèi)標基因的系統(tǒng)分析，我們發(fā)現(xiàn)看家基因GmELF1B在大豆光周期反應(yīng)中較為穩(wěn)定，可用作大豆光周期相關(guān)基因表達研究的內(nèi)標基因。 3.以GmELF1B為內(nèi)標基因，對克隆的四個大豆光周期相關(guān)基因以及通過同源比對篩選到的七個光周期相關(guān)的基因在光周期敏感品種ZGDD成花誘導與開花逆轉(zhuǎn)中的表達進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這11個大豆光周期相關(guān)基因在其成花誘導過程中的不同光周期條件下均有表

5、達，但是長短日條件下的表達量和表達規(guī)律有所不同。它們并非特異地被短日條件誘導，在特定的階段，長日條件也可以誘導它們的表達。 4.所檢測的光周期相關(guān)基因在光周期敏感性不同的大豆品種的SAM中也均有表達，所不同的是，在光周期鈍感品種HH27中這些基因的表達峰值出現(xiàn)的時間普遍比在光周期敏感品種ZGDD中出現(xiàn)的時間早，分子生物學檢測結(jié)果與HH27在短日條件下開花比ZGDD早的生理現(xiàn)象相符合，但是這些基因在ZGDD中的表達峰值卻比HH27

6、中高。 5.對于光周期敏感品種ZGDD而言，經(jīng)一定日數(shù)短日誘導后進行長日照處理，可以產(chǎn)生花序逆轉(zhuǎn)和花逆轉(zhuǎn)，甚至整株逆轉(zhuǎn)，植株回復到營養(yǎng)生長的狀態(tài)。通過研究大豆開花相關(guān)基因在ZGDD開花逆轉(zhuǎn)中的表達發(fā)現(xiàn)，擬南芥分生組織特異基因LFY和AP1的同源基因GmLFY-like和GmAP1-like在逆轉(zhuǎn)條件下的表達介于短日誘導條件和長日抑制條件之間，說明GmLFY-like和GmAP1-like可能具有維持大豆分生組織特性的功能。而光周

7、期上游基因GmGI-like和PEBP家族基因只在逆轉(zhuǎn)早期與GmLFY-like和GmAP1-like的表達相似，說明它們可能住開花逆轉(zhuǎn)的早期發(fā)揮作用。 6.與擬南芥中的基因相似，大豆的光周期相關(guān)基因也呈現(xiàn)24小時的日變化規(guī)律，GmGI-like在長短日條件下的表達與擬南芥在長日下的表達模式相近而與水稻不同；GmCO-like的日變化與水稻Hd1和擬南芥CO均不同，但其在短日條件下的日變化與擬南芥COL1和COL2在長日下的日變

8、化規(guī)律相似；大豆PEBP家族基因在短日下的日變化又與水稻短日下的日變化相似，但長日下的日變化卻不相同，說明光周期凋控大豆相關(guān)基因?qū)θ臻L的響應(yīng)機制可能與長日雙子葉植物擬南芥以及短日單子葉植物水稻均不同。 7.結(jié)合發(fā)根農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化的高效性與百脈根品種“Superroot”簡單、快速的再生體系，本研究建立了一個快速、高效的轉(zhuǎn)化平臺用于豆科植物基因功能的研究。轉(zhuǎn)基因百脈根植株可在兩個半月內(nèi)獲得，分子生物學檢測驗證了轉(zhuǎn)基因事件的發(fā)

9、生。同時，利用雙元轉(zhuǎn)化載體pGFPGUSPlus對一些可能影響轉(zhuǎn)化效率的因子進行優(yōu)化，進而得到92％的高效轉(zhuǎn)化頻率。同時，將一個來源于小麥、編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的耐鹽基因TaNHX2轉(zhuǎn)到百脈根中，并對其耐鹽性進行鑒定，從而驗證此系統(tǒng)作為基因功能研究平臺的實用性。在此基礎(chǔ)上，將大豆中克隆的GmSOC1基因轉(zhuǎn)到了百脈根中使其過表達，導致了百脈根提前開花，從而驗證了此基因促進開花的功能，同時也說明了此轉(zhuǎn)化平臺可以用于逆境生物學與發(fā)育生