玉米光周期敏感相關(guān)基因ZmTFL1的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、光周期敏感性是熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)在溫帶利用的一個(gè)主要障礙。因此，克隆和研究玉米光周期敏感相關(guān)的基因并揭示光周期敏感的遺傳特性和內(nèi)在分子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究以熱帶玉米自交系CML288和溫帶自交系黃早4為材料，利用同源克隆的方法克隆了與擬南芥TFL1、水稻FDR1/FDR2基因同源的玉米ZmTFL1基因。利用熒光定量PCR技術(shù)，研究了不同光周期處理下ZmTFL1基因在光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早4的

2、葉片和莖尖中的表達(dá)情況，以及ZmTFL1基因與ZCN8、DLF1和ZAP1基因之間的表達(dá)關(guān)系。構(gòu)建了ZmTFL1基因的過量表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌浸染花序法轉(zhuǎn)化擬南芥，觀察了轉(zhuǎn)化株的表型，分析了相關(guān)基因的表達(dá)情況，對ZmTFL1基因的功能和作用機(jī)制進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下： 1.利用同源克隆方法，首次克隆了玉米的ZmTFL1基因，GeneBank登錄號為DQ925416。該基因序列含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，CDS序列中含有52

3、2bp完整的開放性閱讀框，推測編碼一條173個(gè)氨基酸的肽鏈。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ZmTFL1與水稻FDR1/FDR2、大麥HvTFL1和黑麥草LpTFL1的同源性分別為91％、85％和83％，但與擬南芥TFL1僅有70％的同源性。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其含有保守的PEBP結(jié)構(gòu)域，且具有TFL1亞家族蛋白獨(dú)特的His88和Asp144殘基，表明ZmTFL1基因?qū)儆谟衩譖EBP基因家族TFL1亞家族的成員。 2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

4、研究了ZmTFL1基因在CML288和黃早4長短日照處理?xiàng)l件下莖尖和葉片中的表達(dá)規(guī)律，分析了ZmTFL1基因與ZCN8、DLF1和ZAP1基因在玉米開花轉(zhuǎn)換過程中的表達(dá)關(guān)系。結(jié)果表明，在長短日照處理?xiàng)l件下，ZmTFL1基因在葉片中僅有微弱的表達(dá)量，但在莖尖中的表達(dá)量很高，且在玉米不同的發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)出高低不同的表達(dá)變化，表明ZmTFL1基因主要在莖尖起作用。基因間的表達(dá)關(guān)系研究表明，ZmTFL1基因在從光周期誘導(dǎo)期向花發(fā)育轉(zhuǎn)換的過程中起抑

5、制作用，而ZCN8基因起促進(jìn)作用，當(dāng)ZCN8基因的表達(dá)量達(dá)到一定的閾值時(shí)，它與ZmTFL1基因競爭結(jié)合DLF1的能力增強(qiáng)，就會解除ZmTFL1基因?qū)ǚ稚M織基因ZAP1的抑制作用，激活ZAP1大量表達(dá)，促進(jìn)花分生組織的發(fā)育，完成開花轉(zhuǎn)換過程。 3.成功構(gòu)建了玉米ZmTFL1基因的過量表達(dá)載體PBI-ZmTFL1，且成功轉(zhuǎn)化擬南芥突變體tfl1-14，獲得3株轉(zhuǎn)基因植株，其中兩株轉(zhuǎn)基因后代與突變體相比，花期延遲了約11天，開花時(shí)

6、的葉片數(shù)增加了5片，另一轉(zhuǎn)基因植株直到衰老也沒有開花。所有的轉(zhuǎn)化株均形成無限花序結(jié)構(gòu)，且葉片表面的毛狀體密度加大，植株高度明顯增加?；虮磉_(dá)模式研究顯示，在突變體tfl1-14植株中，F(xiàn)T基因較弱的表達(dá)量就能激活FD，促進(jìn)花分生組織基因AP1的表達(dá)，形成早花表型，而在轉(zhuǎn)化株中，高量表達(dá)的FT基因才能解除ZmTFL1基因?qū)P1基因的抑制作用，促進(jìn)開花轉(zhuǎn)換。表明ZmTFL1基因能夠抑制開花，且具有與擬南芥TFL1基因相似的功能，是玉米中的