玉米光周期敏感相關基因ZmCOL的克隆及功能驗證.pdf

1、熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)具有豐富的遺傳變異,對其改良并利用可以拓寬中國玉米種質(zhì)遺傳基礎、提升育種水平。然而,光周期敏感性嚴重限制了熱帶、亞熱帶種質(zhì)在溫帶的利用。因此,分離、克隆并研究玉米光周期敏感相關基因并揭示光周期敏感的遺傳特性和內(nèi)在分子機制,對熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的有效利用具有重要的理論和實踐意義。
　　 本研究以光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早4為材料,利用同源克隆的方法克隆了與擬南芥CO、水稻OsHd1同源

2、的玉米ZmCOL基因；利用實時熒光定量PCR法研究了ZmCOL基因的晝夜表達模式,分析了不同發(fā)育時期葉片和莖尖中ZmCOL基因的表達情況及ZmCOL基因與ZmGI和Zm刀基因之間的表達關系；構(gòu)建了ZmCOL基因全長及保守結(jié)構(gòu)域的35S融合表達載體,對ZmCOL基因全長及保守結(jié)構(gòu)域進行了亞細胞定位研究；構(gòu)建了ZmCOL基因的過量表達載體,通過農(nóng)桿菌浸染花序法轉(zhuǎn)化擬南芥,得到了轉(zhuǎn)基因一代植株；通過玉米光周期敏感相關性狀,對21份玉米自交系的

3、光周期敏感性進行了初步鑒定,并結(jié)合這21份材料中ZmCOL基因的序列變異,分析了ZmCOL基因序列變異與玉米光周期敏感性狀的相關性。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用同源克隆等方法,成功克隆了玉米類ZmCOL基因。該基因序列含有2個外顯子和1個內(nèi)含子,CDS序列中含有1197/1188bp的開放性閱讀框,推測編碼一條含有398/395個氨基酸的肽鏈。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),ZmCOL與水稻OsHd1位于同一進化分枝,其親緣關系最近,

4、同源性達87.10％。蛋白結(jié)構(gòu)預測顯示其蛋白含有CO/Hd1基因典型的BBOX和CCT功能域,表明ZmCOL基因是CO/Hd1的同源基因。在光敏感材料CML288和光鈍感材料黃早4的ZmCOL基因的ORF中有一連續(xù)九個堿基的插入/缺失變異,該變異引起了ZmCOL蛋白序列的差異,推測該變異與玉米自交系的光周期敏感程度相關。
　　 2.應用實時熒光定量PCR研究了ZmCOL基因在CML288和黃早4長短日照兩種處理條件下的晝夜節(jié)律表

5、達規(guī)律及其在不同部位、不同的發(fā)育階段的表達規(guī)律,分析了ZmCOL基因與擬南芥GI和刀的在玉米中的同源基因ZmGI、ZmFT的表達關系。結(jié)果表明:在長短日照處理條件下,與擬南芥CO和水稻OsHd1一樣,兩種玉米自交系中ZmCOL基因表達均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性。ZmCOL基因在黃早4和CML288的葉片和莖尖中均有表達,但在玉米的不同發(fā)育時期,ZmCOL基因的表達量呈現(xiàn)出高低不同的動態(tài)變化,其在莖尖和葉片中的表達高峰時期與玉米光周期誘導敏感期一

6、致,表咀ZmCOL基因可能在玉米的光周期誘導敏感期發(fā)揮作用,在該時期ZmCOL基因在不同敏感程度的自交系中的主要表達部位有所不同,在光鈍感材料中ZmCOL基因在葉片的表達量較高,而在光敏感材料中ZmCOL基因在莖尖的表達量較高,但ZmCOL基因在葉片中的表達量最終決定了玉米自交系材料能否正常完成光周期誘導敏感期的光周期誘導?；蜷g的表達關系研究表明,ZmG1基因位于ZmCOL基因的上游,調(diào)控ZmCOL基因的晝夜表達節(jié)律；ZmCOL基因位

7、于ZmFT的上游,在玉米發(fā)育的前期及光周期誘導敏感期發(fā)揮作用；而下游基因ZmFT,在玉米發(fā)育的后期即花發(fā)育敏感時期起調(diào)控作用。
　　 3.成功構(gòu)建了玉米ZmCOL基因的35S融合表達載體并通過基因槍轟擊,使其在洋蔥表皮瞬時表達,結(jié)果表明,ZmCOL是一個核定位蛋白,其保守結(jié)構(gòu)域CCT是該基因唯一的一個核定位信號,具有核定位功能；構(gòu)建了過量表達載體3301-221-ZmCOL,且將該基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥,對陽性候選轉(zhuǎn)基因的PCR鑒

8、定表明,已經(jīng)成功將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥。
　　 4.通過分析21份不同的玉米自交系的光周期敏感性及表型性狀與ZmCOL基因序列變異的相關性,結(jié)果表明,不同種質(zhì)類群的玉米自交系光周期敏感程度不同,其中熱帶種質(zhì)的自交系光周期敏感性最強；表型性狀的動態(tài)聚類將不同玉米自交系光周期敏感程度劃分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級四個等級,隨著等級的升高,其含有的玉米自交系的光周期敏感性越強；ZmCOL基因序列變異位點2+(523-531)與光周期敏感相關