蘇云金芽胞桿菌增強子結(jié)合蛋白的表達純化及功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是蠟樣芽胞桿菌族的一個種，與其它芽胞桿菌相比，Bt的顯著特點是在形成芽胞的同時，還能產(chǎn)生由殺蟲蛋白組成的伴胞晶體。因具有殺蟲效果好，對人類和環(huán)境友好等優(yōu)點而成為廣泛應(yīng)用的殺蟲微生物。Bt中芽胞的形成與伴胞晶體的產(chǎn)量與菌體不同生長時期的代謝模式之間存在一定的關(guān)系。
　　本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Bt HD73菌株中sigL基因（編碼σ54因子）的缺失降低了芽胞形成率和

2、Cry蛋白的產(chǎn)量，說明σ54調(diào)控的代謝途徑可能在芽胞形成及晶體合成上具有重要作用。依賴于σ54的轉(zhuǎn)錄需要增強子結(jié)合蛋白(bacteria Enhancer Binding Proteins，bEBPs)的激活，Bt HD73全基因組中，已發(fā)現(xiàn)8種bEBP，本實驗室目前已經(jīng)構(gòu)建并表達純化了GabR和SoxR兩種蛋白，并驗證了它們在HD73中的功能。GabR和SoxR兩種蛋白分別調(diào)控γ-氨基丁酸(GABA)代謝途徑和肌氨酸代謝途徑。本研究對

3、其它6種bEBP(AcoR、BkdR、KamR、LevR、PrdR和RocR)進行了克隆表達。構(gòu)建了這6種bEBP基因帶有組氨酸(His)標簽的表達載體，并且都能夠在大腸桿菌BL21菌株中進行表達。本研究通過鎳親和層析柱純化得到了BkdR和LevR兩種蛋白，為進一步研究EBP的分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究集中在HD73_1024（編碼脯氨酸消旋酶）、HD73_2025（編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶）、HD73_4161（編碼脯氨酸

4、二肽酶）、HD73_4943（編碼乙酸輔酶A連接酶）和HD73_5327（編碼依賴于NADPH的脫氫酶），5個基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性研究，測定了它們在8個EBP缺失突變體中的轉(zhuǎn)錄活性。β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果表明只有HD73_4161的啟動子在gabR突變體中的活性降低，而其它啟動子在所有bEBP突變體中的活性與HD73野生菌株相比無明顯差異，說明:AcoR、BkdR、GabR、KamR、LevR、PrdR、RcoR和SoxR不是HD7

5、3_1024、HD73_2025、HD73_4943和HD73_5327的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，GabR可能是HD73_4161的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
　　本研究對AcoR參與的3-羥基丁酮代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行了深入的研究。3-羥基丁酮(acetoin)是許多微生物糖代謝的中間產(chǎn)物，對微生物本身具有重要的生理意義:如抵御環(huán)境的酸化、參與NAD+/NADH2比率的調(diào)節(jié)和作為儲存碳源等。在枯草芽胞桿菌、富氧產(chǎn)堿菌（Alcaligenes eutr

6、ophus）和肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）等微生物中，3-羥基丁酮是通過氧化裂解降解的，即通過aco基因簇編碼的3-羥基丁酮脫氫酶系統(tǒng)降解成乙醛和乙酸。BtHD73菌株的3-羥基丁酮脫氫酶系統(tǒng)也由aco基因簇編碼，生物信息學和RT-PCR分析表明Bt HD73的aco基因簇由acoABCL4個基因組成，形成一個轉(zhuǎn)錄單元，aco基因簇的啟動子含有依賴于σ54轉(zhuǎn)錄的-12/-24保守序列。β-半乳糖苷酶活性分析表明