綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物膜抑制作用及其機(jī)制的體內(nèi)外研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)是一種常見(jiàn)的條件致病菌，是引起免疫力低下患者的慢性感染的常見(jiàn)病原體，該菌對(duì)多種常見(jiàn)抗生素耐藥，感染易反復(fù)發(fā)作，難以清除。與其慢性感染密切相關(guān)的是P.a可以形成生物膜(biofilm，BF)，并能分泌多種毒力因子(virulence factors)。BF的形成和維持、毒力因子的合成釋放主要由密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing，QS)調(diào)控。我課題組經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究證

2、明金銀花水煎液可抑制P.a的BF形成，并對(duì)已形成的P.a的BF有明顯的破壞作用[58]；金銀花的主要活性成分為綠原酸(Chlorogenic acid，CA)。因此，本研究采用體外BF模型的方法，探討亞抑菌濃度的CA對(duì)P.a的BF形成的抑制作用；然后研究亞抑菌濃度的CA對(duì)P.a毒力因子(藻酸鹽、彈性蛋白酶、蛋白水解酶、過(guò)氧化物酶、綠膿菌素、鼠李糖脂)釋放的抑制作用；進(jìn)而采用質(zhì)譜方法檢測(cè)亞抑菌濃度的CA對(duì)P.a的QS系統(tǒng)信號(hào)分子的影響，探

3、討其干預(yù)P.a生物膜和毒力因子的分子機(jī)制；再以大鼠腹腔感染模型為基礎(chǔ)，研究QS系統(tǒng)在體內(nèi)BF感染中的作用，以及CA對(duì)體內(nèi)P.a的BF的抑制作用。
　　 第一部分綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用及其機(jī)制的體外研究
　　 第一節(jié)綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌體外生物膜形成的抑制作用
　　 目的：觀察CA對(duì)P.a體外BF形成的抑制作用。方法：(1)檢測(cè)CA、紅霉素(erythromycin，EM)對(duì)PAO1的最低抑菌濃度(m

4、inimal inhibitory concentration，MIC)。(2)采用體外靜置BF模型，分為空白對(duì)照組、EM組和CA組。開(kāi)始建模時(shí)就加入EM(1/8MIC)和CA(1/4MIC)。建模第3天和第7天，采用SEM觀察載體表面BF形態(tài)、結(jié)晶紫染色法半定量載體表面BF。結(jié)果：(1)CA對(duì)P.a的MIC是3000ug/ml，EM對(duì)P.a的MIC是128ug/ml。(2)建模3天，SEM觀察，空白對(duì)照組載體表面可形成早期BF，CA組

5、和EM組載體表面形成的BF規(guī)模明顯小于空白對(duì)照組；建模7天，空白對(duì)照組載體表面可見(jiàn)濃厚黏液樣物質(zhì)，BF呈立體結(jié)構(gòu)，而CA組和EM組僅見(jiàn)薄層BF。不論是建模3天，還是建模7天，結(jié)晶紫染色法BF半定量，CA組不僅少于空白對(duì)照組(P＜0.01)，而且少于EM組(P＜0.05)。結(jié)論：CA可抑制P.a體外BF的形成，且其抑制作用強(qiáng)于EM。
　　 第二節(jié)綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌毒力因子的抑制作用
　　 目的：觀察CA對(duì)P.a毒力因子的

6、抑制作用。方法：(1)建立體外靜置BF模型，分為空白對(duì)照組、EM組和CA組，加入EM(1/8MIC)和CA(1/4MIC)。(2)檢測(cè)培養(yǎng)液藻酸鹽含量；彈性蛋白-剛果紅法測(cè)定菌液中彈性蛋白酶活性；偶氮酪蛋白法測(cè)定建模3、7天的菌液中蛋白水解酶活性；氯仿萃取法測(cè)定建模1、3、5、7天菌液的綠膿菌素的相對(duì)濃度；測(cè)定CA作用后游離菌及BF細(xì)菌對(duì)H2O2的敏感性；苔黑酚—濃硫酸法測(cè)定EM、CA作用后，菌液的鼠李糖脂含量。結(jié)果：(1)培養(yǎng)液中藻酸

7、鹽含量檢測(cè)，CA組不僅少于空白對(duì)照組(P＜0.01)，而且少于EM組(P＜0.05)。(2)與空白對(duì)照組相比，EM組、CA組的彈性蛋白酶活性明顯較低(P＜0.01)，而CA組彈性蛋白酶活性與EM組相當(dāng)(P＞0.05)。(3)無(wú)論是3天，還是7天，與空白對(duì)照組相比，EM組、CA組的蛋白水解酶活性明顯較低(P＜0.01)，但是CA組高于EM組(P＜0.05)。(4)在BF形成的各個(gè)時(shí)期，菌液綠膿菌素相對(duì)濃度測(cè)定，EM組和CA組綠膿菌素相對(duì)濃

8、度均低于空白對(duì)照組(P＜0.01)，CA組綠膿菌素相對(duì)濃度高于EM組(P＜0.05)；(5)在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(4-6h)前，CA組游離P.a與空白組對(duì)H2O2敏感性相當(dāng)(P＞0.05)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，CA組銅綠假單胞菌對(duì)H2O2敏感性強(qiáng)于PAO1空白組(P＜0.05)；3天和7天的H2O2敏感性測(cè)定，EM組和CA組均高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。早期生物膜細(xì)菌CA組對(duì)H2O2敏感性高于EM組(P＜0.05)，而成熟期，CA組對(duì)H2

9、O2敏感性則低于EM組(P＜0.05)。(6)在作用后48h或72h，EM組及CA組的鼠李糖脂均少于空白對(duì)照組(P＜0.01)，作用48h時(shí)CA組鼠李糖脂含量高于EM組(P＜0.05)，作用72h時(shí)CA組鼠李糖脂含量與EM組相當(dāng)(P＞0.05)。結(jié)論：CA可以抑制P.a的多種毒力因子的釋放，對(duì)蛋白水解酶活性、各時(shí)期綠膿菌素，48h鼠李糖脂及成熟期的氧化應(yīng)激的抑制作用弱于EM；對(duì)彈性蛋白酶活性及72h鼠李糖脂抑制作用與EM相當(dāng)；但對(duì)藻酸鹽

10、和早期生物膜細(xì)菌的氧化應(yīng)激的抑制作用高于EM組。
　　 第三節(jié)綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)信號(hào)分子的抑制作用
　　 目的：探討CA對(duì)P.aQS系統(tǒng)信號(hào)分子的抑制作用。方法：(1)乙酸乙酯萃取法提取EM，CA作用后菌液的信號(hào)分子。(2)HPLC-MS鑒定PAO1產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子的種類，并檢測(cè)其信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL，C4-HSL的含量。結(jié)果：(1)PAO1產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子中3-oxo-C12-HSL

11、和C4-HSL含量最高，且在胞外中，C4-HSL的含量高于3-oxo-C12-HSL(P＜0.05)。(2)EM組和CA組的C4-HSL，3-oxo-C12-HSL含量都明顯少于空白對(duì)照組(P＜0.05)，CA對(duì)3-oxo-C12-HSL的抑制作用弱于EM(P＜0.05)，EM組和CA組中，C4-HSL含量無(wú)差別(P＞0.05)。結(jié)論：PAO1產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子主要是3-oxo-C12-HSL和C4-HSL；胞外AHLs信號(hào)分子中，

12、C4-HSL含量高于3-oxo-C12-HSL；CA可以抑制QS系統(tǒng)AHLs信號(hào)分子的產(chǎn)生，其對(duì)3-oxo-C12-HSL的抑制作用比EM弱，而對(duì)于C4-HSL，二者效應(yīng)一致。
　　 第二部分綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用的體內(nèi)研究
　　 第一節(jié)QS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌體內(nèi)生物膜形成中的作用
　　 目的：構(gòu)建大鼠腹腔P.aBF感染模型，初步探討QS系統(tǒng)在BF形成中的作用。
　　 方法：(1)體外準(zhǔn)備：

13、以PVC導(dǎo)管為載體，銅綠假單胞菌PAO1野生株和PAO1△lasRrhlR缺陷株(PA-JP3)在體外培養(yǎng)20h，使其在黏附在載體表面。(2)構(gòu)建大鼠腹腔P.aBF感染模型：48只Wistar大鼠，隨機(jī)分為PAO1組和PA-JP3組，將上述載體植入Wistar大鼠腹腔，建立P.aBF感染模型。建模后分別在第3天，7天和第14天，病理學(xué)觀察腹腔局部組織炎癥變化，SEM觀察載體表面BF變化，連續(xù)稀釋法載體表面菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果：PAO1組腹腔局

14、部組織炎癥反應(yīng)明顯較PA-JP3組嚴(yán)重。第3天、第7天和第14天SEM觀察，載體表面細(xì)菌粘附量均較PA-JP3組多，形成的BF多且稠厚；載體表面菌落計(jì)數(shù)明顯高于PA-JP3組(P＜0.05)；與PA-JP3組相比，機(jī)體對(duì)PAO1組載體細(xì)菌清除緩慢，在第7天后有增多趨勢(shì)(P＜0.05)。結(jié)論：PVC材料可以在大鼠腹膜腔成功構(gòu)建PAO1體內(nèi)BF模型；QS系統(tǒng)在體內(nèi)BF形成中起重要作用。
　　 第二節(jié)綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌體內(nèi)生物膜形成

15、的抑制作用
　　 目的：探討CA對(duì)P.a體內(nèi)BF形成的抑制作用。方法：以銅綠假單胞菌PAO1野生株為實(shí)驗(yàn)菌株，32只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和CA組，建立腹腔感染模型后，腹腔注射CA溶液40mg/kg·d，每12小時(shí)一次，移植物置入后就開(kāi)始腹腔注射，連續(xù)用3d、7d。對(duì)照組用等量的無(wú)菌生理鹽水腹腔注射。建模后分別在第3天和第7天，病理學(xué)觀察腹腔局部組織炎癥變化，SEM觀察載體表面BF變化，連續(xù)稀釋法載體表面菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果：CA干預(yù)后，