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1、目的:腹膜間皮細(xì)胞是構(gòu)成腹膜最主要的細(xì)胞群體,它在維持腹膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的有效性中起著重要的作用,腹膜結(jié)構(gòu)的完整與功能的穩(wěn)定是長(zhǎng)期維持性腹膜透析(continuous ambulatory peritonealldialysis,cAPD)治療的基礎(chǔ)。長(zhǎng)期腹膜透析治療可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而促進(jìn)腹膜纖維化的形成,最終導(dǎo)致腹透超濾失敗,從而迫使患者退出腹膜透析治療,因此CAPD相關(guān)腹膜纖維化的防治成為了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。本
2、研究擬探討高糖是否刺激體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)及對(duì)纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)表達(dá)的影響,同時(shí)應(yīng)用不同濃度的維生素E作為藥物對(duì)照來觀察其在HPMCs發(fā)生氧化應(yīng)激損傷下的保護(hù)作用,為腹膜纖維化的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:從CAPD治療的慢性腎臟病患者
3、腹膜透析流出液中分離并在含10﹪胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞,第二代細(xì)胞應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定,第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。分別按照不同的實(shí)驗(yàn)要求分成濃度依賴組、藥物干預(yù)組。采用ELISA法檢測(cè)HPMCs上清液中FN蛋白水平,采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)半定量分析HPMCs中FNmRNA的基因表達(dá),同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)對(duì)氧化劑敏感的2,7-二氫二氯熒光素(DCFH)發(fā)生氧化所產(chǎn)生的熒光量,
4、從而間接的反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。分別用三種不同濃度的抗氧化劑維生素E(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞,觀察其對(duì)HPMCs內(nèi)源性ROS生成及FN表達(dá)的影響。 1.高糖能顯著誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞FN的分泌與基因表達(dá),呈濃度依賴方式(P<0.01),其中4.25﹪葡萄糖組(高糖組)誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞FN的分泌與基因表達(dá)更加明顯。 2.高糖可明顯刺激體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)活性氧
5、(ROS)的生成,呈濃度依賴方式(P<0.01),在30min測(cè)定平均熒光強(qiáng)度,其中4.25﹪葡萄糖組(高糖組)刺激人腹膜間皮細(xì)胞ROS生成量最高。 3.分別用三種不同濃度的抗氧化劑維生索E預(yù)處理細(xì)胞,與空白對(duì)照組相比,可明顯地降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量,同時(shí)顯著地抑制FN的分泌與基因表達(dá),呈劑量依賴方式(P<0.01),其中維生素E(50μmol/L)組抑制更加明顯。 結(jié)論: 1.高糖可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)
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