脂多糖對人腹膜間皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:腹膜透析(peritonealdialysis，PD)作為治療腎功能衰竭，特別是慢性腎功能衰竭的重要手段，其原理是利用腹膜這一半透膜作為濾過膜，通過腹膜毛細(xì)血管內(nèi)血液和腹腔內(nèi)透析液進(jìn)行水和溶質(zhì)的交換，達(dá)到清除多余水分和代謝廢物的目的。但是長期使用高滲葡萄糖透析液透析，腎衰患者極易發(fā)生腹膜感染，導(dǎo)致腹膜透析超濾衰竭的發(fā)生，這是使患者退出腹透的主要原因。 腹膜透析超濾衰竭(ultrafiltrationfailure，UF)分

2、為四型，其中Ⅰ型為透析液內(nèi)葡萄糖快速吸收，因而腹膜內(nèi)有效滲透壓梯度維持時(shí)間短，超濾效能降低。Ⅰ型腹膜超濾衰竭產(chǎn)生的機(jī)制比較復(fù)雜，目前研究認(rèn)為與高糖透析液的長期應(yīng)用和腹膜炎的發(fā)生有關(guān)。研究提示，腹膜炎可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞下基質(zhì)重構(gòu)和毛細(xì)血管增生，加速小分子溶質(zhì)包括葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使腹膜對水的清除率下降，表現(xiàn)為超濾衰竭。本實(shí)驗(yàn)試圖研究在細(xì)胞水平上，腹膜炎導(dǎo)致超濾衰竭的發(fā)生機(jī)理。 據(jù)報(bào)道，在體外培

3、養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(humanperitonealmesotheliumcells，HPMCs)上有三種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucosetransporter，GLUT)，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)是介導(dǎo)HPMCs葡萄糖攝取的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)上調(diào)，將增加HPMCs對葡萄糖的攝取，降低超濾率。腹膜炎時(shí)，GLUT1的表達(dá)變化如何，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究脂多糖(LPS)對HPMCsGLUT1表達(dá)的影響，來揭示超濾衰竭產(chǎn)生的機(jī)

4、理。 方法:1.胰蛋白酶消化法進(jìn)行HPMCs的原代培養(yǎng)及傳代； 2.間接免疫熒光法進(jìn)行HPMCs的鑒定； 3.免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法檢測HPMCsGLUT1蛋白的表達(dá)，圖像分析系統(tǒng)行光密度掃描半定量分析，以平均光密度(AOD)表示陽性強(qiáng)度； 4.逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測HPMCsGLUT1mRNA的表達(dá)； 5.己糖激酶法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，并計(jì)算出葡萄糖的凈利用；

5、 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)采用SPSS10.0醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示，組間差異的比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。規(guī)定P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:1.HPMCs的鑒定：間接免疫熒光結(jié)果表明，細(xì)胞角蛋白抗體染色在胞漿內(nèi)呈綠色熒光，說明細(xì)胞角蛋白抗原陽性，為間皮細(xì)胞特有，排除了培養(yǎng)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的可能性，證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是HPMCs； 2.不同濃度LPS作用于正

6、常糖濃度(0.1％)中HPMCs，其GLUT1蛋白的表達(dá)。(1)光鏡下免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，HPMCs普遍表達(dá)GLUT1，為棕黃色，在細(xì)胞膜和胞漿中都有表達(dá)，而細(xì)胞核為陰性；(2)不同濃度LPS組，GLUT1的表達(dá)不完全相同(F=467.08，P=0.000)，隨著LPS濃度的升高，GLUT1的表達(dá)也呈上升趨勢；(3)100ug/mL組GLUT1表達(dá)最大，與對照組相比，表達(dá)量為1.16倍(P=0.000)； 3.100ug/

7、mL組LPS作用不同時(shí)間，HPMCsGLUT1的表達(dá)情況。作用1小時(shí)后，GLUT1主要于胞膜上表達(dá)，胞漿中很少，呈“印戒”形，6小時(shí)后，GLUT1在胞漿中表達(dá)漸增多，24小時(shí)表達(dá)量最多(P＜0.01)； 4.用RT-PCR法檢測GLUT1mRNA，結(jié)果表明：(1)隨著LPS濃度升高，GLUT1mRNA的表達(dá)也相應(yīng)增加；100ug/mL組GLUT1mRNA表達(dá)最大，為對照組的1.22倍(P＜0.01)。(2)隨著100ug/mL組

8、LPS作用時(shí)間延長，GLUT1mRNA也呈上升趨勢，作用24h后GLUT1mRNA表達(dá)最大(P＜0.01)，但作用36小時(shí)與作用24小時(shí)相比，無明顯差別； 5.LPS對正常糖濃度下(0.1％)HPMCs葡萄糖凈利用的影響。(1)作用24小時(shí)后，隨著LPS濃度增加，HPMCs葡萄糖凈利用也相應(yīng)增加，100ug/mL組HPMCs葡萄糖凈利用最大(P＜0.01)(2)濃度為100ug/mLLPS分別作用不同時(shí)間后，與對照組相比，HPM

9、Cs葡萄糖凈利用顯著增加，呈時(shí)間依賴性； 6.高糖(4.25％)環(huán)境下，LPS對HPMCsGLUT1表達(dá)的誘導(dǎo)作用。與對照組比較，高糖組及高糖+LPS組GLUT1的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加(P＜0.01)；高糖+LPS組GLUT1的mRNA蛋白表達(dá)量較高糖組也顯著增加(P＜0.05)。 結(jié)論:1.HPMCs普遍表達(dá)GLUT1。2.LPS可以從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平刺激HPMCs增加GLUT1的表達(dá)，并呈濃度和時(shí)間依賴性。