螺內酯對高糖誘導的大鼠腹膜間皮細胞纖維化的影響.pdf

1、研究目的：
　　腹膜透析是(peritoneal dialysis，PD)是利用腹膜作為半透膜，通過轉運和擴散作用，清除體內代謝產物并糾正水電解質失衡的一種腎臟替代治療方法，臨床上應用廣泛。但長期腹膜透析易導致腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)，進而導致腹膜超濾衰竭是腹膜透析的治療過程以失敗告終的主要原因。腹膜間皮細胞(peritoneal mesothelial cells，PMCs)是腹膜彌散和滲透超濾

2、的結構基礎，是腹膜透析中發(fā)揮主要作用的細胞群。長期暴露于高糖、高滲、低pH的非生物相容性腹透液是造成腹膜間皮細胞損傷的主要原因，可導致腹膜組織中PMCs的細胞數(shù)量減少、細胞體積增大，膠原蛋白大量沉積，細胞外基質合成顯著增多，細胞的再生功能和修復功能受到抑制，并伴隨著炎癥細胞的大量增殖以及新生血管的形成，最終導致了腹膜纖維化的發(fā)生。
　　高糖是導致PMCs損害，造成腹膜超濾下降、超濾衰竭的主要原因。高糖可刺激PMCs分泌多種具有促纖

3、維化作用的細胞因子。其中，結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)致纖維化作用的直接下游遞質，通過促進細胞增殖、凋亡、調節(jié)細胞外基質(extracellular matrix，ECM)及促進細胞黏附和趨化等作用，參與各組織臟器纖維化過程。α-平滑肌動蛋白(α-smmoth muscle ac

4、tin，α-SMA)是介導臟器纖維化的重要介質，這一蛋白的高表達誘導細胞分泌細胞外基質的能力增強，并促使細胞的收縮性增加，兩者均在促進臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此，細胞中CTGF和α-SMA的表達決定了組織纖維化的程度。
　　腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)是機體內十分重要的的內分泌系統(tǒng)，它在調節(jié)血壓水平、維持電解質平衡和血容量穩(wěn)定等方面發(fā)

5、揮重要作用。局部RAAS激活與組織重構及纖維化有關。我們已知，醛固酮是RAAS的下游產物，局部RAAS激活可導致醛固酮合成增多，而醛固酮的高表達參與了心肌、肝臟和肺等多臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。在體外培養(yǎng)的腎臟系膜細胞中，醛固酮通過NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，核轉錄因子）途徑誘導腎臟纖維化，并且NF-κB活化的同時伴有CTGF的

6、表達增加。因而進一步研究RAAS與PMCs的相互作用對腹膜纖維化的防治具有重要的理論意義及臨床價值。
　　本研究通過觀察醛固酮拮抗劑-螺內酯對高糖誘導的大鼠腹膜間皮細胞(rat peritoneal mesothelial cells，RPMCs)CYP11B2（醛固酮合成酶）、CTGF、α-SMA及NF-κB因子表達的影響，以探討醛固酮在腹膜纖維化過程中發(fā)揮的作用及其機制。
　　研究方法：
　　1、原代培養(yǎng)大鼠腹膜間

7、皮細胞。
　　2、免疫組化法對培養(yǎng)出的大鼠腹膜間皮細胞進行鑒定。
　　3、在葡萄糖濃度為2.5％(133.3mmol/L)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細胞，應用RT-PCR法和Western blot法檢測大鼠腹膜間皮細胞中CYP11B2的表達，觀察高糖環(huán)境對大鼠腹膜間皮細胞內醛固酮合成的影響。
　　4、給予不同劑量醛固酮拮抗劑-螺內酯干預后，通過RT-PCR法和Western blot法檢測大鼠腹膜間皮細胞中CYP11

8、B2、CTGF、α-SMA、NF-κB的表達，觀察螺內酯對高糖誘導的上述因子表達的影響。
　　研究結果：
　　1、大鼠腹膜間皮細胞的原代培養(yǎng)與鑒定
　　在顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的細胞融合后呈現(xiàn)為多角形，鋪路石樣外觀，這是腹膜間皮細胞的典型的形態(tài)特征。免疫組化染色可見RPMCs的細胞角蛋白和波形蛋白染色為陽性，第Ⅷ因子相關抗原及白細胞CD45抗原染色為陰性，證明該細胞為RPMCs。
　　2、高糖環(huán)境下，大鼠腹膜間皮細胞

9、中CYP11B2的表達
　　通過RT-PCR法和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，正常RPMCs中CYP11B2僅有少量表達，當用含2.5％葡萄糖的培養(yǎng)液分別刺激RPMCs12h、24h及48h后，各組RPMCs中CYP11B2的表達顯著增加，作用時間越長，增加越明顯。(P＜0.05)
　　3、螺內酯對高糖誘導的CYP11B2、CTGF、α-SMA、NF-κB表達的影響
　　分別給予含有0.25μmol/L、2.5μ

10、mol/L及25μmol/L螺內酯的培養(yǎng)液干預高糖培養(yǎng)下的RPMCs48h后，各組CYP11B2、CTGF、α-SMA、NF-κB的表達受到抑制，給藥劑量越大，抑制作用越強。(P＜0.05)
　　研究結論：
　　1、高糖以時間依賴方式誘導醛固酮合成增加，同時伴有促纖維化因子α-SMA、CTGF的表達上調。
　　2、醛固酮拮抗劑-螺內酯以濃度依賴方式能抑制醛固酮的合成，并同時下調α-SMA、CTGF的表達。
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