螺內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞纖維化的影響.pdf

1、研究目的：
　　腹膜透析是(peritoneal dialysis，PD)是利用腹膜作為半透膜，通過轉(zhuǎn)運和擴散作用，清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物并糾正水電解質(zhì)失衡的一種腎臟替代治療方法，臨床上應(yīng)用廣泛。但長期腹膜透析易導(dǎo)致腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)，進而導(dǎo)致腹膜超濾衰竭是腹膜透析的治療過程以失敗告終的主要原因。腹膜間皮細(xì)胞(peritoneal mesothelial cells，PMCs)是腹膜彌散和滲透超濾

2、的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是腹膜透析中發(fā)揮主要作用的細(xì)胞群。長期暴露于高糖、高滲、低pH的非生物相容性腹透液是造成腹膜間皮細(xì)胞損傷的主要原因，可導(dǎo)致腹膜組織中PMCs的細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞體積增大，膠原蛋白大量沉積，細(xì)胞外基質(zhì)合成顯著增多，細(xì)胞的再生功能和修復(fù)功能受到抑制，并伴隨著炎癥細(xì)胞的大量增殖以及新生血管的形成，最終導(dǎo)致了腹膜纖維化的發(fā)生。
　　高糖是導(dǎo)致PMCs損害，造成腹膜超濾下降、超濾衰竭的主要原因。高糖可刺激PMCs分泌多種具有促纖

3、維化作用的細(xì)胞因子。其中，結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)致纖維化作用的直接下游遞質(zhì)，通過促進細(xì)胞增殖、凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及促進細(xì)胞黏附和趨化等作用，參與各組織臟器纖維化過程。α-平滑肌動蛋白(α-smmoth muscle ac

4、tin，α-SMA)是介導(dǎo)臟器纖維化的重要介質(zhì)，這一蛋白的高表達誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強，并促使細(xì)胞的收縮性增加，兩者均在促進臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此，細(xì)胞中CTGF和α-SMA的表達決定了組織纖維化的程度。
　　腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)是機體內(nèi)十分重要的的內(nèi)分泌系統(tǒng)，它在調(diào)節(jié)血壓水平、維持電解質(zhì)平衡和血容量穩(wěn)定等方面發(fā)

5、揮重要作用。局部RAAS激活與組織重構(gòu)及纖維化有關(guān)。我們已知，醛固酮是RAAS的下游產(chǎn)物，局部RAAS激活可導(dǎo)致醛固酮合成增多，而醛固酮的高表達參與了心肌、肝臟和肺等多臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。在體外培養(yǎng)的腎臟系膜細(xì)胞中，醛固酮通過NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，核轉(zhuǎn)錄因子）途徑誘導(dǎo)腎臟纖維化，并且NF-κB活化的同時伴有CTGF的

6、表達增加。因而進一步研究RAAS與PMCs的相互作用對腹膜纖維化的防治具有重要的理論意義及臨床價值。
　　本研究通過觀察醛固酮拮抗劑-螺內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞(rat peritoneal mesothelial cells，RPMCs)CYP11B2（醛固酮合成酶）、CTGF、α-SMA及NF-κB因子表達的影響，以探討醛固酮在腹膜纖維化過程中發(fā)揮的作用及其機制。
　　研究方法：
　　1、原代培養(yǎng)大鼠腹膜間

7、皮細(xì)胞。
　　2、免疫組化法對培養(yǎng)出的大鼠腹膜間皮細(xì)胞進行鑒定。
　　3、在葡萄糖濃度為2.5％(133.3mmol/L)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR法和Western blot法檢測大鼠腹膜間皮細(xì)胞中CYP11B2的表達，觀察高糖環(huán)境對大鼠腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)醛固酮合成的影響。
　　4、給予不同劑量醛固酮拮抗劑-螺內(nèi)酯干預(yù)后，通過RT-PCR法和Western blot法檢測大鼠腹膜間皮細(xì)胞中CYP11

8、B2、CTGF、α-SMA、NF-κB的表達，觀察螺內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的上述因子表達的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、大鼠腹膜間皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定
　　在顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的細(xì)胞融合后呈現(xiàn)為多角形，鋪路石樣外觀，這是腹膜間皮細(xì)胞的典型的形態(tài)特征。免疫組化染色可見RPMCs的細(xì)胞角蛋白和波形蛋白染色為陽性，第Ⅷ因子相關(guān)抗原及白細(xì)胞CD45抗原染色為陰性，證明該細(xì)胞為RPMCs。
　　2、高糖環(huán)境下，大鼠腹膜間皮細(xì)胞

9、中CYP11B2的表達
　　通過RT-PCR法和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，正常RPMCs中CYP11B2僅有少量表達，當(dāng)用含2.5％葡萄糖的培養(yǎng)液分別刺激RPMCs12h、24h及48h后，各組RPMCs中CYP11B2的表達顯著增加，作用時間越長，增加越明顯。(P＜0.05)
　　3、螺內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的CYP11B2、CTGF、α-SMA、NF-κB表達的影響
　　分別給予含有0.25μmol/L、2.5μ

10、mol/L及25μmol/L螺內(nèi)酯的培養(yǎng)液干預(yù)高糖培養(yǎng)下的RPMCs48h后，各組CYP11B2、CTGF、α-SMA、NF-κB的表達受到抑制，給藥劑量越大，抑制作用越強。(P＜0.05)
　　研究結(jié)論：
　　1、高糖以時間依賴方式誘導(dǎo)醛固酮合成增加，同時伴有促纖維化因子α-SMA、CTGF的表達上調(diào)。
　　2、醛固酮拮抗劑-螺內(nèi)酯以濃度依賴方式能抑制醛固酮的合成，并同時下調(diào)α-SMA、CTGF的表達。
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