線粒體生物合成的改變對高糖誘導的活性氧簇生成的影響.pdf

1、隨著經濟發(fā)展和居民生活方式的改變，我國糖尿病的患病率急劇上升。據國家衛(wèi)生部調查顯示，我國每天新增糖尿病患者3000例，每年約增加120萬。2007年，國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）根據2002年前糖尿病患病率發(fā)布了中國2025年糖尿病人數(shù)預計數(shù)據為4610萬，但同時提出這一預測數(shù)據可能低估了中國的糖尿病現(xiàn)狀。而糖尿病慢性并發(fā)癥所包括的微血管病變（視網膜病變、腎臟病變、神經病變）和心腦血管病變（冠心病、腦卒中、周圍血管病），為糖尿病致殘、致死的

2、重要原因。最新統(tǒng)計，我國城市治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的年直接醫(yī)療費用為187.5億元，占衛(wèi)生總費用的3.94%。因此，深入研究糖尿病并發(fā)癥產生機制，探索預防和治療并發(fā)癥新的途徑和方法，具有重要的意義。 自1966年始超過1，3000篇報導先后指出高血糖導致組織損傷的各種途徑，其中主要包括四條經典途徑：一、多元醇途徑的激活；二、晚期糖基化終末產物（AGE）的形成增加；三、蛋白激酶C（PKC）的激活；四、氨基己糖途徑的激活。然而既往

3、似乎沒有一種元素能將上述四條途徑聯(lián)系起來，且各種分別抑制上述途徑的臨床試驗并未能使糖尿病并發(fā)癥獲得理想的療效。2002年，美國紐約愛因斯坦醫(yī)學院糖尿病研究中心Michael Brownlee教授首次提出糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學說，他指出高血糖導致血管內皮細胞線粒體生成過多活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是糖尿病血管病發(fā)病機制中最上游的因素。ROS在細胞內的積聚進而激活上訴四條經典的組織損傷途徑。

4、 當血糖升高時，進入內皮細胞內的葡萄糖增多，因而有更多的葡萄糖進入線粒體參加三羧酸循環(huán)（TCA），繼而產生更多的還原型輔酶Ⅰ（NADH）和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），兩者通過電子傳遞鏈氧化磷酸化，為ATP的產生提供能量。另外，當細胞內葡萄糖明顯升高時，糖酵解增加，產生NADH和丙酮酸，NADH可通過穿梭系統(tǒng)將還原當量傳遞給線粒體，而丙酮酸可進入線粒體參加TCA，產生NADH和FADH2，后兩者亦通過電子傳遞鏈氧化磷酸化，為A

5、TP的產生提供能量。在電子傳遞過程中，線粒體內膜兩側的電化學電位梯度增加，當此電位梯度達某一閾值后，電子傳遞在呼吸鏈復合體Ⅲ水平受抑制，導致電子在輔酶Q（CoQ）水平儲備，進而引起CoQ傳遞電子過程中的中間態(tài)形式半泛醌的半衰期延長，半泛醌可將一個電子傳遞給O2還原成過氧化物，后者與NO相互作用產生過氧化亞硝酸鹽（ONOO-）。過氧化物經SOD2作用轉化為H2O2，在亞鐵和亞銅離子存在時，形成更具反應性的羥基（·OH）。ONOO-和·OH

6、可導致廣泛的氧化損傷，促進脂質的過氧化、降低NO的生物活性，并可使蛋白酪氨酸硝基化，影響多種信號的轉導，如激活NF-κ B、P38-MAPK途徑，導致內皮細胞功能障礙。 ROS在細胞內的積聚進而激活四個經典的組織損傷途徑。其主要原因是ROS可導致DNA單鏈斷裂，激活多（ADP-核糖）聚合酶（Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP），活化的PARP可使ADP-核糖從其底物NAD+解離，轉移到自身或其他蛋白

7、上，NAD+的耗竭可消耗ATP，導致細胞功能障礙。糖酵解途徑中的關鍵酶-磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）被PARP核糖基化后活性降低，使糖酵解中間代謝產物進入其他途徑：磷酸二羥丙酮（DHAP）生成DAG增多，激活PKC；磷酸丙糖生成甲基乙二醛，形成AGEs：6-磷酸果糖生成6-磷酸葡糖胺，激活氨基己糖途徑；葡萄糖進入多元醇通路消耗NADPH和谷胱甘肽。 ROS激活的下游途徑可進一步增加過氧化物的產生，形成一個正反饋回路，且各條途徑

8、間相互作用，放大氧化應激損傷。ROS激活的下游途徑主要包括：一、激活依賴PKC的NADPH氧化酶；二、ROS誘導eNOS解偶聯(lián)，從高，表明細胞內線粒體數(shù)量增多：相反，通過siRNA抑制PGC-1α在細胞內表達導致細胞總DNA中細胞色素b DNA降低，表明細胞內線粒體數(shù)量減少。 2.分別將空病毒Ad、Ad-PGC-1α以及人PGC-1α siRNA轉染人臍帶靜脈內皮細胞（HUVEC）。轉染48小時后，收集細胞并裂解抽提細胞總DNA

9、。取1μg細胞總DNA進行Southern印跡雜交。結果顯示通過腺病毒感染過度表達PGC-1α導致細胞總DNA中細胞色素b DNA升高，表明細胞內線粒體數(shù)量增多；相反，通過siRNA抑制PGC-1α在細胞內表達導致細胞總DNA中細胞色素bDNA降低，表明細胞內線粒體數(shù)量減少。 3.高糖組BAEC內的ROS濃度（0.32±0.12）和HUVEC內的ROS濃度（0.28±0.13）均明顯高于正常糖組細胞ROS的濃度，P<0.001；

10、 4.高糖組BAEC內的eNOS活性（3042.20±1657.62）和HUVEC內的eNOS活性（3005.51±1642.30）均明顯高于正常糖組的細胞，P<0.001； 5.在BAEC內pcDNA3.1/V5-His-TOPO-PGC-1α轉染組的ROS濃度（0.16±0.01）明顯低于對照組及空質粒轉染組，P<0.001。eNOS活性（4773.71±961.25）明顯高于對照組及空質粒轉染組，P<0.001。

11、 6.在HUVEC內Ad-PGC-1α感染組的ROS濃度（0.14±0.02）明顯低于對照組及空病毒Ad感染組，P<0.001。eNOS活性（4712.62±948.16）明顯高于對照組及空病毒Ad轉染組，P<0.001。 7.在BAEC內PGC-1α siRNA轉染組的ROS濃度（0.40±0.10）明顯高于對照組及空質粒轉染組，P<0.001。eNOS活性（1274.35±96.02）明顯低于對照組及空質粒轉染組，P<

12、0.001。 8.在HUVEC內PGC-1α siRNA轉染組的ROS濃度（0.37±0.12）明顯高于對照組及空病毒Ad感染組，P<0.001。eNOS活性（1207.80±118.54）明顯低于對照組及空病毒Ad感染組，P<0.001。 結論: 1.細胞內過度表達PGC-1α蛋白后，Southern印跡雜交顯示細胞總DNA中細胞色素b的拷貝數(shù)增多，表明細胞內線粒體的生物合成提高，同時對細胞內ROS的檢測顯示細