線粒體生物合成的改變對高糖誘導的活性氧簇生成的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、隨著經濟發(fā)展和居民生活方式的改變,我國糖尿病的患病率急劇上升。據國家衛(wèi)生部調查顯示,我國每天新增糖尿病患者3000例,每年約增加120萬。2007年,國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)根據2002年前糖尿病患病率發(fā)布了中國2025年糖尿病人數(shù)預計數(shù)據為4610萬,但同時提出這一預測數(shù)據可能低估了中國的糖尿病現(xiàn)狀。而糖尿病慢性并發(fā)癥所包括的微血管病變(視網膜病變、腎臟病變、神經病變)和心腦血管病變(冠心病、腦卒中、周圍血管病),為糖尿病致殘、致死的

2、重要原因。最新統(tǒng)計,我國城市治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的年直接醫(yī)療費用為187.5億元,占衛(wèi)生總費用的3.94%。因此,深入研究糖尿病并發(fā)癥產生機制,探索預防和治療并發(fā)癥新的途徑和方法,具有重要的意義。 自1966年始超過1,3000篇報導先后指出高血糖導致組織損傷的各種途徑,其中主要包括四條經典途徑:一、多元醇途徑的激活;二、晚期糖基化終末產物(AGE)的形成增加;三、蛋白激酶C(PKC)的激活;四、氨基己糖途徑的激活。然而既往

3、似乎沒有一種元素能將上述四條途徑聯(lián)系起來,且各種分別抑制上述途徑的臨床試驗并未能使糖尿病并發(fā)癥獲得理想的療效。2002年,美國紐約愛因斯坦醫(yī)學院糖尿病研究中心Michael Brownlee教授首次提出糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學說,他指出高血糖導致血管內皮細胞線粒體生成過多活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是糖尿病血管病發(fā)病機制中最上游的因素。ROS在細胞內的積聚進而激活上訴四條經典的組織損傷途徑。

4、 當血糖升高時,進入內皮細胞內的葡萄糖增多,因而有更多的葡萄糖進入線粒體參加三羧酸循環(huán)(TCA),繼而產生更多的還原型輔酶Ⅰ(NADH)和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2),兩者通過電子傳遞鏈氧化磷酸化,為ATP的產生提供能量。另外,當細胞內葡萄糖明顯升高時,糖酵解增加,產生NADH和丙酮酸,NADH可通過穿梭系統(tǒng)將還原當量傳遞給線粒體,而丙酮酸可進入線粒體參加TCA,產生NADH和FADH2,后兩者亦通過電子傳遞鏈氧化磷酸化,為A

5、TP的產生提供能量。在電子傳遞過程中,線粒體內膜兩側的電化學電位梯度增加,當此電位梯度達某一閾值后,電子傳遞在呼吸鏈復合體Ⅲ水平受抑制,導致電子在輔酶Q(CoQ)水平儲備,進而引起CoQ傳遞電子過程中的中間態(tài)形式半泛醌的半衰期延長,半泛醌可將一個電子傳遞給O2還原成過氧化物,后者與NO相互作用產生過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)。過氧化物經SOD2作用轉化為H2O2,在亞鐵和亞銅離子存在時,形成更具反應性的羥基(·OH)。ONOO-和·OH

6、可導致廣泛的氧化損傷,促進脂質的過氧化、降低NO的生物活性,并可使蛋白酪氨酸硝基化,影響多種信號的轉導,如激活NF-κ B、P38-MAPK途徑,導致內皮細胞功能障礙。 ROS在細胞內的積聚進而激活四個經典的組織損傷途徑。其主要原因是ROS可導致DNA單鏈斷裂,激活多(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP),活化的PARP可使ADP-核糖從其底物NAD+解離,轉移到自身或其他蛋白

7、上,NAD+的耗竭可消耗ATP,導致細胞功能障礙。糖酵解途徑中的關鍵酶-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)被PARP核糖基化后活性降低,使糖酵解中間代謝產物進入其他途徑:磷酸二羥丙酮(DHAP)生成DAG增多,激活PKC;磷酸丙糖生成甲基乙二醛,形成AGEs:6-磷酸果糖生成6-磷酸葡糖胺,激活氨基己糖途徑;葡萄糖進入多元醇通路消耗NADPH和谷胱甘肽。 ROS激活的下游途徑可進一步增加過氧化物的產生,形成一個正反饋回路,且各條途徑

8、間相互作用,放大氧化應激損傷。ROS激活的下游途徑主要包括:一、激活依賴PKC的NADPH氧化酶;二、ROS誘導eNOS解偶聯(lián),從高,表明細胞內線粒體數(shù)量增多:相反,通過siRNA抑制PGC-1α在細胞內表達導致細胞總DNA中細胞色素b DNA降低,表明細胞內線粒體數(shù)量減少。 2.分別將空病毒Ad、Ad-PGC-1α以及人PGC-1α siRNA轉染人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)。轉染48小時后,收集細胞并裂解抽提細胞總DNA

9、。取1μg細胞總DNA進行Southern印跡雜交。結果顯示通過腺病毒感染過度表達PGC-1α導致細胞總DNA中細胞色素b DNA升高,表明細胞內線粒體數(shù)量增多;相反,通過siRNA抑制PGC-1α在細胞內表達導致細胞總DNA中細胞色素bDNA降低,表明細胞內線粒體數(shù)量減少。 3.高糖組BAEC內的ROS濃度(0.32±0.12)和HUVEC內的ROS濃度(0.28±0.13)均明顯高于正常糖組細胞ROS的濃度,P<0.001;

10、 4.高糖組BAEC內的eNOS活性(3042.20±1657.62)和HUVEC內的eNOS活性(3005.51±1642.30)均明顯高于正常糖組的細胞,P<0.001; 5.在BAEC內pcDNA3.1/V5-His-TOPO-PGC-1α轉染組的ROS濃度(0.16±0.01)明顯低于對照組及空質粒轉染組,P<0.001。eNOS活性(4773.71±961.25)明顯高于對照組及空質粒轉染組,P<0.001。

11、 6.在HUVEC內Ad-PGC-1α感染組的ROS濃度(0.14±0.02)明顯低于對照組及空病毒Ad感染組,P<0.001。eNOS活性(4712.62±948.16)明顯高于對照組及空病毒Ad轉染組,P<0.001。 7.在BAEC內PGC-1α siRNA轉染組的ROS濃度(0.40±0.10)明顯高于對照組及空質粒轉染組,P<0.001。eNOS活性(1274.35±96.02)明顯低于對照組及空質粒轉染組,P<

12、0.001。 8.在HUVEC內PGC-1α siRNA轉染組的ROS濃度(0.37±0.12)明顯高于對照組及空病毒Ad感染組,P<0.001。eNOS活性(1207.80±118.54)明顯低于對照組及空病毒Ad感染組,P<0.001。 結論: 1.細胞內過度表達PGC-1α蛋白后,Southern印跡雜交顯示細胞總DNA中細胞色素b的拷貝數(shù)增多,表明細胞內線粒體的生物合成提高,同時對細胞內ROS的檢測顯示細

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