活性維生素D3及其受體對(duì)人系膜細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：探討活性維生素D3[1,25(OH)2D3]及其受體對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)的影響，初步探討1,25(OH)2D3及其受體通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：（1）體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EGF(10ng/ml)組、1,25(OH)2D3（10-8mol/L）組、EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組，

2、通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察各組干預(yù)48h后對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)的影響（2）采用CCK-8法檢測(cè)各組干預(yù)48h后對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響（3）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組干預(yù)48h后對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響（4）TUNEL法檢測(cè)各組干預(yù)48h后對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響（5）RT-PCR檢測(cè)各組干預(yù)48h后對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞中mTORmRNA、nVDRmRNA表達(dá)的影響（6）采用western-blot法檢測(cè)各組干預(yù)48h

3、后人腎小球系膜細(xì)胞中mTOR、nVDR蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)倒置相差顯微鏡下觀察人腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)，正常對(duì)照組細(xì)胞胞體呈梭形，胞核居中，圓形或卵圓形，可見(jiàn)樹(shù)枝狀突起，部分突起相互融合成網(wǎng)格形；與正常對(duì)照組比較，EGF組細(xì)胞生長(zhǎng)增快，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核增大，可見(jiàn)雙核細(xì)胞，1,25(OH)2D3組細(xì)胞的生長(zhǎng)被顯著抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，體積變小，核濃縮成點(diǎn)狀，胞漿濃縮甚至出現(xiàn)空泡，EGF聯(lián)合1,25(OH)2

4、D3組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況欠佳，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞質(zhì)的折光性欠佳，細(xì)胞核體積略小，胞質(zhì)中可見(jiàn)少量空泡形成。
　?。?）CCK-8法檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞增殖：與正常對(duì)照組相比，EGF組能顯著促進(jìn)人腎小球系膜細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組能顯著抑制人腎小球系膜細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制或促進(jìn)作用（P＞0.05）；與EGF

5、組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組均能顯著抑制人腎小球系膜細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞周期：與正常對(duì)照組相比，EGF組G1期細(xì)胞顯著減少，S期細(xì)胞顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組G1期細(xì)胞顯著增多，S期顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組G1期、S期細(xì)胞均無(wú)顯著性變化（P＞0.05）

6、；與EGF組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組G1期細(xì)胞顯著增多，S期細(xì)胞顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　(4)TUNEL法檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡：與正常對(duì)照組相比，EGF組人腎小球系膜細(xì)胞的凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞的凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性變化（P＞

7、0.05）；與EGF組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）。
　　（5）RT-PCR檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞中mTORmRNA的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，EGF組人腎小球系膜細(xì)胞中mTORmRNA的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞中mTORmRNA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人

8、腎小球系膜細(xì)中mTORmRNA的表達(dá)無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與EGF組相比，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞中mTORmRNA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；
　　(6)RT-PCR檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞中nVDRmRNA的表達(dá)：各實(shí)驗(yàn)組均未見(jiàn)nVDRmRNA的表達(dá)。
　?。?）western-blot檢測(cè)人腎小球系膜細(xì)胞中mTOR的表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，EGF組人腎小球系膜細(xì)胞中m

9、TOR蛋白的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與EGF組比較，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組人腎小球系膜細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　?。?）western-blot檢測(cè)