漆酶基因轉(zhuǎn)化羊草的研究.pdf

1、羊草(Leymus chinensis)是分布于我國北方天然草地面積較廣、營養(yǎng)價值較高的禾本科牧草，近年來，羊草草原缺乏科學(xué)管理，以及過度放牧等不利影響，加之羊草本身固有的“三低”問題(即抽穗率低、結(jié)實率低、發(fā)芽率低)已對羊草生物多樣性維持構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，羊草資源日趨退化；其次，由于羊草中過高的木質(zhì)素含量，不利于它在動物體內(nèi)的消化分解，因此為了使畜牧業(yè)更為健康的發(fā)展，需要選育木質(zhì)素含量較低的新品種，漆酶是一種結(jié)合多個銅離子的蛋白質(zhì)，屬

2、于銅藍氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空氣中，發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水，它本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素，我們可以用漆酶基因轉(zhuǎn)化羊草，以Bar基因作為篩選標(biāo)記，以期獲得低木質(zhì)素含量的轉(zhuǎn)基因羊草，最終提高羊草中營養(yǎng)成分在動物體內(nèi)的利用率，本課題主要取得了以下成果： 1、通過對羊草種子愈傷的誘導(dǎo)和再生條件的改進，初步建立了羊草再生體系，重新優(yōu)化了羊草遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。 (1)提高了羊草愈傷組織誘導(dǎo)率 為了提高成熟胚

3、的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，設(shè)計了不同的培養(yǎng)基及不同的激素濃度。羊草愈傷組織誘導(dǎo)采用MS培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基中激素2，4-D的濃度達到2.0mg/L時即可達到較好的誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)率為20％，當(dāng)濃度為2.0 mg/L時誘導(dǎo)率達到了30％，羊草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳2，4-D濃度為2.0mg/L。 (2)羊草愈傷組織的繼代培養(yǎng)條件的優(yōu)化 羊草愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳2，4-D濃度為1.5-2.0mg/L. N6和MS培養(yǎng)基是較適宜的羊草愈

4、傷組織繼代培養(yǎng)基，通過這兩種培養(yǎng)基交替培養(yǎng)可以改善愈傷的狀態(tài)。在繼代培養(yǎng)中蔗糖較適宜的濃度為30-40g/l。培養(yǎng)基中脯氨酸濃度為2500mg/L，是羊草愈傷組織的生長以及胚性狀態(tài)保持較適宜的濃度。 (3)羊草愈傷組織的分化及再生條件的優(yōu)化 培養(yǎng)基中加入1mg/L6-BA為羊草愈傷組織分化最佳條件，分化率達到了25％。生根培養(yǎng)基中加入NAA的最適宜濃度為2.0mg/L。如果在愈傷組織分化前進行預(yù)分化10-30天，可以明顯

5、提供分化出苗率。 2、羊草愈傷組織耐除草劑敏感性測定 綜合增重指數(shù)和愈傷組織生長狀態(tài)兩種因素考慮，羊草愈傷組織在高Basta濃度條件下，可以篩選出耐除草劑突變體植株。從0mg/L開始篩選，通過逐步提高Basta濃度的方法，最終獲得了篩選濃度為20mg/L耐除草劑植株的愈傷組織，并成功分化出6株幼苗。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其葉色淺綠，株型低矮，與一般分化植株明顯不同。 3、羊草基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化 不同的轟擊距離