玉米和黑麥草漆酶基因的克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析及玉米水分脅迫下基因表達研究.pdf

1、本研究利用基因同源序列克隆技術、cDNA-AFLP技術和生物信息學技術，一方面，進行黑麥草和玉米漆酶基因的克隆與分析；另一方面，對水分脅迫條件下4個玉米自交系材料的基因表達情況進行深入研究，確定與玉米抗旱相關的功能基因，從而為遺傳工程改良飼料作物的消化率和增強玉米種質的抗旱性提供重要的物質基礎和理論依據。這對于我國農業(yè)種植結構調整和畜牧業(yè)的發(fā)展以及實施高效節(jié)水農業(yè)均具有一定的理論和實踐意義。 通過對參與木質素合成途徑中一個重要酶

2、-漆酶的系統(tǒng)分析與克隆以及利用cDNA-AFLP技術對不同抗旱性的玉米種質在水分脅迫條件下的基因表達規(guī)律進行了研究，獲得了以下主要結果： 1.以64個不同來源的植物漆酶為材料，對其氨基酸序列進行了比較分析，并進行了分子進化機制的探討。發(fā)現漆酶作為藍銅氧化酶蛋白家族的成員，具有一個或數個不等的保守區(qū)域(HWHG和HLHG)及N糖基化結合位點。系統(tǒng)發(fā)生關系表明，植物漆酶是一個高度趨異的多基因家族，在種子植物分化為被子植物和裸子植物的

3、前后，均可能發(fā)生了基因復制； 2.進一步通過對64個漆酶的一系列特征進行分析發(fā)現：同一物種的不同漆酶成員在序列上差異很大；在單子葉和雙子葉植物中均有細胞外和細胞內漆酶蛋白；糖基化位點數目(8-23個)和等電點值的變化范圍都很大(5-10)；漆酶的催化底物廣泛；在不同組織中差異表達。因此，植物漆酶除了參與木質素的生物合成外，還可能具有其它功能； 3.在27個水稻漆酶基因中，有9個位于第9號染色體上，6個位于第11號染色體上

4、。這就意味著超過一半的漆酶成員集中在2條染色體上。水稻第1號染色體上的漆酶基因分散在3個不同的區(qū)段，從GRLC26到GRLC1跨越了21Mb。GRLC26位于區(qū)段1(15371897-15374072bp)；GRLC6位于區(qū)段2(25214631-25216628bp)。區(qū)段3為GRLC5和GRLC1之間(1.3Mb)，該區(qū)域位于C126435和C15960標記之間。位于第11號染色體上的漆酶基因，聚集于3個區(qū)段。其中，GRLC8、GR

5、LC11、GRLC12、GRLC15位于短臂末端。我們發(fā)現GRLC11、GRLC12和GRLC15與水稻的一個MYB轉錄因子的基因克隆在染色體上的位置相近。17個擬南芥漆酶基因只有AtLC1和AtLC7分布于第1、4號染色體，其余則密集分布于第2、5號染色體。依據已經發(fā)表的擬南芥基因組部分復制區(qū)域，我們發(fā)現在第3號染色體的AtLC7和第5號染色體的AtLC8、AtLC9、AtLC10、AtLC11和AtLC12之間發(fā)生了基因復制；

6、 4.擬南芥16個漆酶基因的數字化Northern分析結果顯示，多數基因在根和莖組織強烈表達。AtLC2和AtLC17在不同組織的表達模式基本相同，二者在莖組織顯著表達，而且它們的序列非常相似。AtLC7和AtLC8也具有相似的情況，二者在根部均強烈表達，而且其序列的同源性也很高，在分子進化關系圖譜中同屬于一個類群； 5.以一個黑麥草作圖群體的兩個親本F＃30和F＃39的基因組DNA為模板，利用5對黑麥草特異引物，進行漆酶基因

7、克隆。最終得到3個黑麥草漆酶基因片段Lac10-1、Lac10-1、Lac11-2。同源搜索發(fā)現，它們與已經克隆的植物漆酶具有較高的同源性，并且含有保守的銅離子結合位點([HWH]和[HAH])； 6.設計了21對用于玉米漆酶基因克隆的特異引物，并在此基礎上利用KWS公司的8個玉米自交系材料，克隆了168個漆酶基因片段；以M13進行正、反向測序(336個反應)，共得到有效序列81個。對其中一組cDNA克隆的氨基酸序列進行分析，找

8、到一個屬于多銅氧化酶基因家族的COG2132，SufI保守域； 7.將玉米漆酶基因ZmP7定位到H21×Mo17作圖群體的第4號染色體短臂的nc004(Bin4.03)和phi026(Bin4.05)標記之間； 8.利用cDNA-AFLP技術檢測到水分脅迫條件下，差異表達條帶近500條，回收cDNA帶380條，最終得到有效序列42個；GeneBank數據庫中搜索發(fā)現：1個cDNA沒有相匹配的序列；2個片段的同源序列為功能

9、未知的蛋白；15個cDNA的同源序列均為功能未知的玉米克隆；4個cDNA的同源序列為功能未知的水稻克隆。在所剩余的20個功能已知的cDNA片段中，既有與干旱脅迫相關的重要功能蛋白((牛龍)牛兒酰(牛龍)牛兒基還原酶、3-磷酸脫氫酶、線粒體轉運蛋白、丙糖磷酸轉運蛋白)、也有一些重要的轉錄因子(蛋白激酶C、GTP結合蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、鋅指蛋白、MYB)等； 9.在所克隆的一個玉米漆酶基因片段ZmP7-AS30的啟動子區(qū)域