三七總皂苷抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、遷移及機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。該病早期癥狀隱匿,導(dǎo)致患者就診時(shí)常處于晚期從而失去手術(shù)機(jī)會(huì)。因此藥物治療對(duì)于改善晚期患者的生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期具有重要意義。三七總皂苷(total panax notoginsengsaponins,tPNS)是中藥三七根中提取的藥用成分,主要包括三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)、人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)、人參皂苷Re(Ginsenoside Re)、人參皂苷

2、Rb1(Ginsenoside Rb1)和人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd)等。由于三七總皂苷具有活血化瘀的功能,由上述藥用化合物組成的三七總皂苷注射液已被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的臨床治療。近來研究結(jié)果證實(shí),tPNS及tPNS中的部分單體成分具有抗腫瘤的功能。然而,tPNS對(duì)前列腺癌的作用尚不清楚,因此本研究通過觀察tPNS對(duì)體外培養(yǎng)的人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的作用,并探討其作用機(jī)制,旨在為前列腺癌的輔助治療及擴(kuò)

3、展tPNS的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1人前列腺癌PC-3細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將人前列腺癌PC-3細(xì)胞傳代培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至70％左右時(shí),進(jìn)行藥物刺激。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度的tPNS進(jìn)行處理,對(duì)照組細(xì)胞用生理鹽水進(jìn)行處理。
　　 2細(xì)胞增殖分析
　　 使用MTT法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行分析,以測(cè)定tPNS對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響。
　　 3流式細(xì)胞學(xué)分析

4、
　　 將各組細(xì)胞消化并吹打成單細(xì)胞懸液,經(jīng)固定、洗滌、染色等過程后,進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析,以測(cè)定tPNS對(duì)PC-3細(xì)胞周期分布及凋亡的影響。
　　 4免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　 將細(xì)胞接種于玻片上,經(jīng)tPNS處理后,將各組細(xì)胞用甲醛固定。經(jīng)Triton X-100處理、封閉、一抗及二抗結(jié)合、DAB顯色等步驟后鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占比例。
　　 5傷口愈合實(shí)驗(yàn)
　　 將PC-3細(xì)胞接種于玻片上,待細(xì)胞至1

5、00％匯合時(shí)進(jìn)行劃痕,藥物處理24 h后計(jì)數(shù)遷移入損傷區(qū)的細(xì)胞數(shù)量。
　　 6總RNA提取及RT-PCR反應(yīng)
　　 提取各組細(xì)胞的總RNA,經(jīng)定量后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),之后將反應(yīng)產(chǎn)物用特異PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)電泳后半定量檢測(cè)VCAM-1的表達(dá)變化。
　　 7 Western印跡分析
　　 取等量細(xì)胞總蛋白,經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,恒流電轉(zhuǎn)膜至NC膜上,經(jīng)脫脂牛奶封閉、一抗及二抗結(jié)合、化學(xué)發(fā)光等過程

6、,對(duì)特定蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　 8明膠酶圖分析
　　 取等體積細(xì)胞培養(yǎng)液,進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。之后經(jīng)復(fù)性、明膠酶反應(yīng)、染色、脫色等步驟后檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases2,MMP-2)的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1 tPNS抑制PC-3細(xì)胞增殖但不促進(jìn)該細(xì)胞株凋亡
　　 MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示,tPNS抑制PC-3增殖活力(P

7、＜0.05)。Western印跡及免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明,tPNS處理PC-3細(xì)胞后增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)增加,增殖抑制基因p21Cip1表達(dá)水平降低(P＜0.05)。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果證實(shí),促進(jìn)PC-3細(xì)胞阻滯于G1期但tPNS不能誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡峰。凋亡促進(jìn)蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平在tPNS處理后變化不明顯(P＞0.05)。
　　 2 tPNS抑制PC-3細(xì)胞遷移
　　 傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示

8、,tPNS對(duì)PC-3細(xì)胞遷移有顯著的抑制作用(P＜0.01)。Western印跡及明膠酶圖結(jié)果顯示,遷移相關(guān)蛋白MMP-2在tPNS處理后表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(P＜0.01);Western印跡及RT-PCR結(jié)果表明,tPNS處理的PC-3細(xì)胞后,血管細(xì)胞間黏附分子1(vascular celladhesion molecule1,VCAM-1)表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.01),該作用呈現(xiàn)顯著的時(shí)效及量效關(guān)系。以上結(jié)果表明,tPNS

9、抑制PC-3細(xì)胞遷移的作用可能與下調(diào)MMP-2及黏附分子VCAM-1的表達(dá)水平有關(guān)。
　　 3 tPNS激活p38 MAPK通路
　　 在tPNS處理PC-3細(xì)胞0.5h時(shí),p38 MAPK磷酸化水平顯著升高,之后該蛋白的磷酸化水平開始逐漸降低,但仍維持較高水平(P＜0.01)。而ERK及JNK的磷酸化水平不明顯。因此推測(cè),p38 MAPK通路的活化可能是tPNS對(duì)PC-3細(xì)胞作用的重要途徑。
　　 結(jié)論: