GnT-V RNAi對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響.pdf

1、[課題背景]
　　 前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性生殖系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率為歐美國(guó)家男性惡性腫瘤的第1位和死亡率第2位。我國(guó)PCa的發(fā)病率雖低于歐美國(guó)家,但隨著生活方式改變、人口老齡化及前列腺特異性抗原(PSA)廣泛應(yīng)用于篩查,近年來(lái),PCa的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)PSA篩查研究發(fā)現(xiàn),50歲以上男性的前列腺癌發(fā)病率為0.78％,提示中國(guó)的前列腺癌實(shí)際發(fā)病率并不低。因此,尋找前列腺癌有

2、效治療方法已成為一個(gè)急待解決的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 生物體內(nèi)的大多數(shù)蛋白質(zhì)都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖鏈直接影響著糖蛋白生物功能的發(fā)揮。N-糖鏈的結(jié)構(gòu)改變是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟,在腫瘤細(xì)胞中,復(fù)雜糖鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變,且這種變化與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是一個(gè)與腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶,研究表明GnT-V在很

3、多惡性腫瘤中增多,其產(chǎn)物GIcNAcβ1,6 Manal,6結(jié)構(gòu)有利于外鏈的延伸,已發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。
　　 基因治療是一種有前景的腫瘤治療手段,RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的基因功能研究手段,它是利用與靶基因同源的小片段雙鏈RNA(dsRNA),即siRNA,轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,促進(jìn)靶基因mRNA降解,從而特異性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。將siRNA

4、所對(duì)應(yīng)的模板DNA雙鏈序列克隆入質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,DNA模板在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成小片段發(fā)夾狀RNA(shRNA),與化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)具有相同的基因封閉作用,但作用時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月,因其特異性和高效性成為當(dāng)前腫瘤基因治療的熱點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用RNAi原理和技術(shù),針對(duì)前列腺癌中高表達(dá)基因GnT-V的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移潛能的人前列腺癌PC-3細(xì)胞,觀察RNAi對(duì)GnT-V基因表達(dá)的抑制效應(yīng),尋找抑制效率較

5、高的RNAi片段,為尋找有效治療前列腺癌分子靶向研究中新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　 (1)GnT-VsiRNA序列的設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中CnT-V基因已知序列(NM_002410.3)和siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)針對(duì)GnT-VcDNA的RNA片段,其序列為:GnT-V/1079 sense'GGAAGTGCATGC

6、AACTGTTTA 3’；經(jīng)Blast檢索確認(rèn)與GnT-V以外的人類已知基因序列無(wú)同源性。將其中一對(duì)的序列打亂排列,通過(guò)Blast分析無(wú)同源性超過(guò)70％的序列,作為陰性對(duì)照干擾序列,序列為:GnT-V/NC sense5'GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’。由上海吉瑪公司采用化學(xué)合成方法合成上述siRNA。
　　 (2)shRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA的設(shè)計(jì):根據(jù)前面設(shè)計(jì)的siRNA序列,設(shè)計(jì)模板DNA鏈,其順序分別為Bbs

7、 Ⅰ酶切位點(diǎn)、正義序列、9nt loop連接序列、反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子(6個(gè)T)、BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。
　　 (3)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的構(gòu)建及鑒定:先將各組2條模板單鏈退火處理,再與雙酶切后的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒連接,構(gòu)建成重組體質(zhì)粒。將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選卡那霉素抗性克隆,利用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ和BamH Ⅰ雙酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。大量擴(kuò)增搖菌后,抽提質(zhì)粒純化。

8、r>　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
　　 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃、5％C02濕度下培養(yǎng),每周傳代2～3次。PC-3細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,參照invitrogen公司Lipofectamine2000TM產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM將質(zhì)粒導(dǎo)入PC-3細(xì)胞。
　　 3、干擾效果檢測(cè)
　　 (1)半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢

9、測(cè)GnT-V mRNA表達(dá)
　　 轉(zhuǎn)染成功后,繼續(xù)培養(yǎng)PC-3細(xì)胞48h后,收集細(xì)胞,經(jīng)Trizol一步法提取總RNA,采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)。GnT-V上游引物為5’AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3’,下游引物為5’TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度為555bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán)；

10、最后72℃再延伸10min.以β-actin為內(nèi)參,上游引物為5’GAAACTACCTTCAACTCCATC 3’,下游引物為5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度為219 bp。以擴(kuò)增產(chǎn)物3μ1在2％瓊脂糖凝膠中電泳,攝像后使用Image.Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度分析,用GnT-V/β-actin灰度比值作為GnT-V的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 (2)蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)檢測(cè)G

11、nT-V蛋白表達(dá)
　　 轉(zhuǎn)染成功后,繼續(xù)培養(yǎng)PC-3細(xì)胞72h后,每組收集1×107個(gè)細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞裂解液提取總蛋白并進(jìn)行定量。取50μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳完成后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5％脫脂奶粉的PBST緩沖液封閉PVDF膜。然后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗體(1:200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過(guò)夜,洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(1:400)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1

12、:9000),室溫下?lián)u動(dòng)1h,按說(shuō)明書(shū)使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色,成像,底片掃描后使用Image.Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度分析,用GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 4、GnT-VshRNA對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、粘附及侵襲的影響
　　 (1)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖性
　　 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)細(xì)胞,CCK-8法分析不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h、96h)的細(xì)胞活力,

13、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)8個(gè)復(fù)孔。測(cè)量?jī)山M的OD450nm值,繪制生長(zhǎng)曲線,并計(jì)算干擾組的生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=(對(duì)照組OD450值-干擾組OD450值)/對(duì)照組OD450值×100％.
　　 (2)異質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)
　　 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)細(xì)胞,每組設(shè)24個(gè)孔。細(xì)胞用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)過(guò)夜。Matrigel膠50μL/孔鋪96孔板,10g/L BSA煮沸13min變性后封閉,按5×103/孔加入細(xì)胞懸液

14、,37℃孵育1h。1×PBS沖洗3次,CCK-8法測(cè)量各組OD450nm值。
　　 (3)趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)24孔趨化小室檢測(cè)細(xì)胞遷移性,趨化因子為10％新生牛血清。結(jié)果表示為穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),顯微鏡下每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)(400×)。
　　 (4)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)細(xì)胞,細(xì)胞接種于包被CollagenⅣ的6

15、孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞呈現(xiàn)出單層貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)。分別在各組單細(xì)胞層上劃痕,用含10％FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0h、12h、24h、36 h每個(gè)孔取4個(gè)視野拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前兩側(cè)細(xì)胞層距離-愈合后兩側(cè)細(xì)胞層距離)/愈合前兩側(cè)細(xì)胞層距離]×100％.
　　 (5)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)24孔趨化小室和matr

16、igel膠檢測(cè)細(xì)胞侵襲性.結(jié)果表示為穿過(guò)matrigel膠和聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),顯微鏡下每個(gè)復(fù)孔隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)(400×)。
　　 [統(tǒng)計(jì)學(xué)方法]
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,兩組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1、靶向GnT-V的shRNA表達(dá)質(zhì)?？梢燥@著下調(diào)人前列腺癌PC-3細(xì)胞Gn