運(yùn)用CRISPR-Casq系統(tǒng)對(duì)大麥維生素E合成相關(guān)基因進(jìn)行編輯的研究.pdf

1、CRISPR（clustered regulatory interspersed short palindromic repeat）序列源于原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng)，基于RNA介導(dǎo)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可定點(diǎn)修飾（刪除、添加、激活、抑制）靶細(xì)胞中特定的基因序列。自2013年以來，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚、酵母、細(xì)菌、果蠅、線蟲、擬南芥、水稻等物種中。大麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，其富含維生

2、素E，尤其含有人體易于吸收且生物活性高的α-生育酚。維生素E的合成途徑復(fù)雜，有八種類型的產(chǎn)物（δ、γ、β、α-生育酚，δ、γ、β、α-生育三烯酚）。HGGT基因（homogentisate geranylgeranyl transferase gene）和HPT基因(homogentisatephytyltransferase gene)分別是生育酚和生育三烯酚合成的兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因。目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為新型的基因組編輯

3、技術(shù)在大麥中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。在本研究中，我們主要開展了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在大麥原生質(zhì)體水平上的研究，通過對(duì)HGGT基因編輯系統(tǒng)的建立以期達(dá)到調(diào)控維生素E合成的目的。本研究比較了不同CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體Cas9蛋白在大麥中的表達(dá)水平，針對(duì)靶基因HGGT設(shè)計(jì)特定靶位點(diǎn)并進(jìn)行了基因突變實(shí)驗(yàn)，采用RE-qPCR(Restrictionenzyme-quantitative PCR)方法計(jì)算基因突變率。此外我們還比較了兩種突變

4、檢測(cè)方法(RE-PCR和PCR-RE)。獲得主要結(jié)果如下:
　　1.Cas9蛋白在大麥原生質(zhì)體中的表達(dá)水平
　　以pRGE載體為基本骨架，構(gòu)建了適用于植物的CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體。Western Blot結(jié)果顯示，細(xì)菌來源的Cas9蛋白在大麥中的表達(dá)量較低，經(jīng)過密碼子優(yōu)化和選用UBI10啟動(dòng)子可以大幅度提高Cas9蛋白在大麥中的表達(dá)水平。
　　2.靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)以及表達(dá)載體的構(gòu)建
　　選擇大麥維生素E合成途

5、徑中的HGGT基因作為靶基因，以pRGE32載體為基本骨架，針對(duì)HGGT基因的三個(gè)位點(diǎn)，構(gòu)建了三個(gè)突變單一靶位點(diǎn)的sgRNA(single gRNA)體系載體 pRGE32-HGGT-1、 pRGE32-HGGT-2、pRGE32-HGGT-3和一個(gè)同時(shí)突變兩個(gè)靶位點(diǎn)的PTG(Polycistronic-tRNA-gRNA)體系載體pRGE32-HGGT-PTG1。
　　3.突變檢測(cè)方法的比較
　　傳統(tǒng)的T7E1酶檢測(cè)突變體

6、的方法穩(wěn)定性較差，本實(shí)驗(yàn)選取了帶有常見限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的序列作為靶位點(diǎn)，便可根據(jù)該位點(diǎn)是否能被原有的限制性內(nèi)切酶切開來篩選突變DNA序列，采用RE-PCR法（先酶切再PCR）和PCR-RE法（先PCR再酶切）均成功檢測(cè)到靶位點(diǎn)發(fā)生了突變。結(jié)果顯示，PCR-RE法更加簡便快捷，反應(yīng)條件穩(wěn)定，限制性因素少，還有利于后續(xù)突變片段的回收。
　　4.突變率、突變類型的統(tǒng)計(jì)與計(jì)算
　　回收的突變片段連接pGEM-T載體后，隨機(jī)挑取單

7、克隆測(cè)序，可以直接統(tǒng)計(jì)突變類型并計(jì)算突變率。本實(shí)驗(yàn)中采取了簡單有效、成本低的RE-qPCR方法來間接計(jì)算突變率。針對(duì)單一靶位點(diǎn)編輯，RE-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HGGT-1位點(diǎn)突變率為4.56％，HGGT-2位點(diǎn)為0.35％，HGGT-3位點(diǎn)為1.51％。測(cè)序結(jié)果顯示，CRISPR-Cas技術(shù)在大麥原生質(zhì)體水平進(jìn)行HGGT基因編輯，主要導(dǎo)致點(diǎn)突變（T-C置換、A-G置換）和片段缺失（20 bp靶位點(diǎn)不同長度的缺失），分別占總突變的89.4

8、7％和10.53％，其中HGG T-1位點(diǎn)突變率為35％，HGGT-3位點(diǎn)為15％，HGGT-PTG1位點(diǎn)為35％。RE-qPCR和測(cè)序結(jié)果均表明HGGT基因的三個(gè)不同位點(diǎn)突變率相差很多，HGGT-1位點(diǎn)最高，HGGT-3位點(diǎn)其次，HGGT-2位點(diǎn)沒有檢測(cè)到突變。該實(shí)驗(yàn)說明不同靶位點(diǎn)的突變效率差異很大，因此進(jìn)行高效編輯靶位點(diǎn)的篩選顯得十分重要。
　　綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了CRISPR-Cas技術(shù)作為基因組編輯工具能夠在大麥