阻斷二氮嗪后處理對(duì)大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化的影響.pdf

1、背景與目的:
　　 研究心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制及其防治措施，對(duì)減少心肌疾病的死亡率具有重要意義。二氮嗪能激活A(yù)TP敏感性鉀離子通道（mitoKATPC）產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，此作用能被5-羥葵酸阻斷。mitoKATPC被阻斷時(shí)，心肌線粒體蛋白的表達(dá)會(huì)發(fā)生怎樣的變化，這些變化與心功能有著怎樣的聯(lián)系。從亞細(xì)胞蛋白質(zhì)水平上認(rèn)識(shí)心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，將有助于為心臟疾病的治療提供依據(jù)。
　　 利用大鼠心肌缺血再灌注

2、損傷模型及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，觀察5-羥葵酸阻斷二氮嗪后處理對(duì)大鼠心功能的影響以及線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，為尋找藥物后處理的作用靶點(diǎn)，為潛在的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)建立大鼠心臟缺血再灌注損傷模型:雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為正常組(Nor)、缺血再灌注損傷組（I/R）、二氮嗪后處理組(DZ)、5-羥葵酸阻斷二氮嗪后處理組(5-HD+DZ)，每組6只。灌注方

3、案:Nor組:持續(xù)灌注Kerbs-Henseleit緩沖液(K-H液)120min，不作停跳缺血處理。I/R組、DZ組、5-HD+DZ組，在灌注K-H液平衡20 min后，灌注4℃ST.Thomas停跳液，使全心停跳缺血40 min，分別按以下方案行再灌注:I/R組:灌注K-H液60 min; DZ組:灌注K-H液前給予50μmol/L二氮嗪2 min，繼之K-H液58 min;5-HD+DZ組:灌注100μmol/L5-羥葵酸3min

4、后，接著灌注50μmol/L二氮嗪2 min，然后灌注K-H液55 min。記錄各組平衡末和續(xù)灌末心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVDEP)、以及最大dp/dt等心臟功能的變化，并收集心室組織用于供線粒體蛋白質(zhì)的提取;
　　 2.差速離心及Nycodenz密度梯度離心提取、純化大鼠心肌線粒體，并利用透射電鏡驗(yàn)證線粒體純度;
　　 3.提取心肌線粒體蛋白質(zhì)，行雙向凝膠電泳(2-DE)、染色、凝膠掃描后

5、獲取2-DE圖像，用PD-Quest8.0軟件分析5-HD+DZ組相對(duì)DZ組蛋白點(diǎn)豐度變化，選取差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)，將其挖取、酶解、質(zhì)譜分析后獲得相關(guān)差異蛋白質(zhì)的譜圖;采用MALDI-TOF-MS鑒定;
　　 4.利用western blot回復(fù)驗(yàn)證關(guān)鍵差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)，以判斷2-DE結(jié)果的可靠性;
　　 結(jié)果:
　　 1.Nycodenz密度梯度離心法能得到富集度較高的線粒體;
　　 2.平衡末

6、各組間心功能無明顯差異。灌注末Nor組及DZ組的心功能優(yōu)于I/R組和5-HD+DZ組(P＜0.05）。5-HD+DZ組與I/R組間心功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 3.將5-HD+DZ組和DZ組線粒體蛋白行2-DE，凝膠圖像經(jīng)PD-Quest軟件分析后，得到的圖像聚焦良好、重復(fù)性高，兩組膠平均檢測出650±22個(gè)蛋白斑點(diǎn);質(zhì)譜分析鑒定出符合要求（線粒體蛋白、Mascot score＞60）的蛋白質(zhì)5個(gè);
　　 4.與DZ組

7、比較，5-HD+DZ組表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)分別為:Spot2504(琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞基，SDHA)、5806（2-酮戊二酸脫氫酶，OGDH）、7204（丙酮酸脫氫酶E1組件β亞基，PDHE1β）、7604（線粒體內(nèi)膜蛋白，IMMT）;表達(dá)上調(diào)的蛋白為:Spot9101(NADH黃素蛋白亞基2，NDUFV2);
　　 5.Western blot回復(fù)驗(yàn)證，差異蛋白SDHA及OGDH在5-HD+DZ組中的表達(dá)較DZ組低，與2DE結(jié)

8、果相吻合;
　　 結(jié)論:
　　 1.二氮嗪后處理能夠激活mitoK(ATP)通道產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，此效應(yīng)能被5-HD阻斷;
　　 2.5-HD阻斷mitoKATP通道后會(huì)造成心功能受損，從而影響與維系線粒體能量代謝和呼吸鏈穩(wěn)定有關(guān)的三個(gè)蛋白(SDHA、OGDH、PDHE1β)的表達(dá)下調(diào)，提示這些蛋白和mitoKATP通道存在一定的聯(lián)系;
　　 3.mitoK(ATP)通道被5-HD阻斷后，可促使NDUFV