鴨甲肝病毒1和3型一步法雙重RT-PCR檢測方法的建立及應用.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是雛鴨的一種急性傳染性病，主要侵害4周齡以內的雛鴨。該病由至少三種不同的病原引起，包括鴨甲肝病毒(DHAV)、1型鴨星狀病毒(DastV-1)和2型鴨星狀病毒(DastV-2)。分布范圍最廣的DHAV屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬?；谥泻驮囼灪拖到y發(fā)育分析，DHAV已被分為三種基因型(DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3)。其中，DHAV-1分布范圍最廣泛，DHAV-2僅在臺灣發(fā)現報道，而近幾年DHAV-3已經

2、給我國大陸地區(qū)和韓國的養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重危害。DHAV-1與DHAV-2之間無交叉中和反應，DHAV-1和DHAV-3之間交叉保護作用不明顯。通過對雛鴨的臨床癥狀和剖檢病變可以初步對DVH進行診斷，但是該方法不能夠區(qū)分DHAV-1和DHAV-3。目前血清學診斷技術和分子生物學診斷技術已經用DHAV的檢測和診斷，血清學診斷技術主要包括中和試驗、間接血凝試驗、瓊脂擴散試驗和免疫熒光抗體技術等，但是由于其繁瑣耗時和成本高，不能用于快速診斷。分子生

3、物學診斷技術包括RT-PCR和RT-LAMP方法等，能夠快速特異地對DHAV分離株和臨床樣品進行診斷，因此建立一種能夠快速鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3的一步法雙重RT-PCR方法對我國DVH的防治有積極的作用。
　　1.建立一步法雙重RT-PCR方法用于檢測DHAV-1和DHAV-3
　　為了能夠快速鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3，本研究根據GenBank中DHAV-1和DHAV-3的全基因組序列，在DHAV-1和

4、DHAV-3的基因保守區(qū)域分別設計了2對特異性引物，并成功建立一步法雙重RT-PCR方法鑒別診斷DHAV-1和DHAV-3。該一步法雙重RT-PCR方法能夠分別針對DHAV-1和DHAV-3特異性地擴增出992bp和1533bp的目的片段，而對健康雛鴨肝臟組織、番鴨細小病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒、禽流感病毒、鴨疫里默氏菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌核酸的檢測結果為陰性。該方法最低能夠檢測出10pg DHAV-1和DHA

5、V-3的RNA，具有較高的敏感性。
　　2.應用一步法雙重RT-PCR方法檢測DHAV-1和DHAV-3
　　本研究中使用建立好的一步法雙重RT-PCR方法DHAV人工感染雛鴨和DHAV分離株進行檢測，結果顯示該一步法雙重RT-PCR方法的檢測結果和病毒分離實驗完全一致。應用建立好的一步法雙重RT-PCR方法對從2012～2014年在四川、山東、湖北和廣西省采集的52份疑似DVH病料進行檢測，結果顯示52份病料中有41份為D