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1、3型鴨甲肝病毒(DHAV-3)是嚴(yán)重危害雛鴨的病原,雛鴨感染可造成嚴(yán)重發(fā)病和死亡。本研究試圖建立檢測(cè)DHAV-3的免疫組化方法,對(duì)該病毒在感染雛鴨體內(nèi)的分布進(jìn)行定位檢測(cè),探索DHAV-3在感染雛鴨體內(nèi)分布規(guī)律,為闡明DHAV-3的致病機(jī)理提供參考數(shù)據(jù),為本病的診斷和甲醛保存樣品的回顧性診斷提供可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
1.檢測(cè)DHAV-3免疫組化方法的建立
DHAV-3接種10日齡鴨胚,收集36h~72h死亡高峰期的且
2、胚體病變情況明顯的鴨胚尿囊液,用差速離心-氯仿抽提-超速離心獲得初步純化DHAV-3抗原,免疫家兔后獲得兔抗DHAV-3高免血清,提取兔抗DHAV-3 IgG,建立和優(yōu)化了檢測(cè)DHAV-3免疫組化方法。該法能夠特異性檢測(cè)DHAV-3感染雛鴨組織(心臟、肝臟、脾臟等)的病毒抗原,而鴨瘟、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病死亡雛鴨和健康雛鴨呈現(xiàn)陰性反應(yīng),具有良好的特異性。
2.雛鴨不同途徑人工感染DHAV-
3、3病理模型的構(gòu)建和免疫組化檢測(cè)
對(duì)300只無(wú)母源抗體1日齡雛鴨隨機(jī)分成4組,1~3攻毒組90只/組,對(duì)照組30只,飼養(yǎng)至3日齡進(jìn)行人工感染,攻毒組感染途徑分別為口服、滴鼻、肌肉注射,劑量為0.4ml/只的DHAV-3感染死亡3日齡雛鴨肝臟勻漿,4組注射生理鹽水為對(duì)照。攻毒組在人工感染后的1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、192h、240h、14d時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)剖殺6只,對(duì)照
4、組剖殺2只,采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、胰腺、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、法氏囊、哈氏腺、胸腺、肌肉16個(gè)組織器官的樣品,使用4%的多聚甲醛固定,記錄各組雛鴨的發(fā)病死亡數(shù)量和死亡時(shí)間段,應(yīng)用建立的免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)。
人工感染后的24h~26h肌注組最先出現(xiàn)死亡,口服組和滴鼻組的雛鴨最初出現(xiàn)死亡時(shí)間相近,即人工感染后的36h~38h內(nèi)。各組死亡高峰期均處于36h~72h,隨著時(shí)間的推移,口服組、滴鼻組和肌注
5、組雛鴨的死亡數(shù)量都在48h左右到達(dá)最高峰,隨后呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),肌注組在96h內(nèi)雛鴨死亡數(shù)量呈正態(tài)分布趨勢(shì)??诜M、滴鼻組和肌注組的試驗(yàn)分別于攻毒后的144h、192h和120h結(jié)束,滴鼻組的死亡情況最為嚴(yán)重,其次是口服組,肌注組死亡最少,對(duì)照組未出現(xiàn)死亡情況。
收集的感染DHAV-3死亡雛鴨心臟、肝臟、脾臟等16個(gè)組織器官均能檢測(cè)出強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào),不同途徑感染鴨體內(nèi)的病毒分布情況則表明DHAV-3侵害雛鴨的主要靶器官為肝臟、脾臟
6、、腎臟和腸道。隨著感染時(shí)間的推移,靶器官陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì),至72h左右達(dá)到最強(qiáng)。法氏囊、哈氏腺、胸腺為代表的免疫器官陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度呈現(xiàn)強(qiáng)弱交替的情況,其余的非靶器官呈現(xiàn)中等或弱陽(yáng)性。
3.不同時(shí)間點(diǎn)DHAV-3病毒抗原在雛鴨組織內(nèi)的定位和分布情況
人工感染后1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、192h三組雛鴨體內(nèi)組織器官病毒分布情況如下:
7、 (1)口服組:十二指腸、空腸、回腸、直腸、法氏囊、哈氏腺、胸腺7個(gè)組織器官在攻毒后1h就檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào),心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸5個(gè)組織器官在攻毒后4h檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào),胰腺、肺臟在攻毒后6h有陽(yáng)性信號(hào)呈現(xiàn),肌肉在攻毒后24h檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào),大腦在攻毒后36h組化結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性。
(2)肌注組:攻毒后1h十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、法氏囊、哈氏腺、胸腺、肌肉10個(gè)組織器官中就能檢測(cè)出3型鴨甲肝病毒,攻毒后2h肝臟、腎臟
8、中也分布有病毒抗原,心臟、脾臟、肺臟在攻毒后4h檢測(cè)出病毒抗原,胰腺在攻毒后12h檢測(cè)出病毒抗原,大腦在攻毒后36h檢測(cè)出病毒抗原。
(3)滴鼻組:心臟、法氏囊在攻毒后2h組化結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性,肌肉在攻毒后4h組化結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性,其余組織均在攻毒后的1h就檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)。
綜上:本研究建立的免疫組化檢測(cè)DHAV-3的方法具有良好的特異性,可用于DHAV-3感染雛鴨組織的亞細(xì)胞定位、DHAV-3感染死亡雛鴨的診斷、甲醛保存樣
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