快速鑒別診斷不同亞型鴨肝炎病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DVH）是由鴨病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起雛鴨的一種發(fā)病急、死亡快、死亡率高的疾病，主要感染3周齡以?xún)?nèi)的雛鴨剖檢病變主要存在于肝臟。根據(jù)2009年的國(guó)際病毒分類(lèi)委員第十次分類(lèi)報(bào)告，將DHV分為鴨甲肝病毒(DHAV)，鴨星狀病毒1型(DAstV-1)，鴨星狀病毒2型(DAstV-1)三個(gè)血清型。同時(shí)，DHAV又包括三個(gè)基因亞型或血清亞型，分別

2、稱(chēng)為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。鴨肝炎病毒的三個(gè)血清型及鴨甲肝病毒三個(gè)亞型之間均沒(méi)有明顯的抗原交叉保護(hù)，給鴨肝炎病毒的防治帶來(lái)了很大的困難。DHAV-1一直是我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)血清型，但近年來(lái)DHAV-3在我國(guó)廣泛流行，甚至一些地區(qū)出現(xiàn)DHAV-1和DHAV-3共流行的現(xiàn)象，DAstV-1在我國(guó)的出現(xiàn)由進(jìn)一步增加了鴨病毒性肝炎的防治難度。本研究建立了可以快速鑒別診斷不同亞型鴨肝炎病毒單純或混合感染的多重RT-PCR方法，并對(duì)2

3、011年從山東，四川，河南，廣東四省隨機(jī)采集的病料以及2012年從山東省不同鴨場(chǎng)采集的病料進(jìn)行了鑒別診斷。本研究共分為三個(gè)部分:
　　 1、鴨星狀病毒W(wǎng)F1201株的分離鑒定及全基因組測(cè)序與分析
　　 參照GenBank中已發(fā)表的DAstV-1全基因組序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)DAstV-1檢測(cè)引物，并建立了相應(yīng)的RT-PCR方法。應(yīng)用這兩對(duì)檢測(cè)引物分別對(duì)四川和山東采集的24份臨床病料進(jìn)行了DAstV-1的檢測(cè)，其中9份檢測(cè)出DAs

4、tV-1。將DAstV-1陽(yáng)性病料研磨后接種9日齡鴨胚和1日齡雛鴨，結(jié)果接種鴨胚未見(jiàn)死亡，胚體也無(wú)明顯病變，但大部分鴨胚的尿囊液呈綠色或黃綠色，應(yīng)用建立的RT-PCR方法從接種的鴨胚中均檢測(cè)到了DAstV-1。雛鴨接種后，有20％的雛鴨在48h內(nèi)出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，繼而死亡，死亡鴨剖檢可見(jiàn)肝臟腫大有出血點(diǎn)，其余鴨飼養(yǎng)1周均未見(jiàn)死亡。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的DAstV-1全基因組序列設(shè)計(jì)了10對(duì)重疊引物和2對(duì)Reace-PCR引物，對(duì)WF

5、1201株DAstV-1進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增和序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，該株毒具有星狀病毒基因的典型特征:在RF1a和ORF1b的重疊區(qū)存在一個(gè)7堿基滑動(dòng)序列AAAAAAC，其下游存在一個(gè)可配對(duì)形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列。序列分析結(jié)果表明該毒株與江蘇分離株C-NGB的親緣關(guān)系較近，全基因組核苷酸具有98.7％的同源性。WF1201株DAstV-1全基因組序列傳至GenBank，收錄號(hào)為JX439643。
　　 2、鴨甲肝病毒1型和3型雙重R

6、T-PCR方法的建立及應(yīng)用
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的72株DHAV-1和20株DHAV-3的全基因組序列，選擇各自保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了2對(duì)特異性引物。應(yīng)用這2對(duì)引物，分別建立了檢測(cè)DHAV-1
　　 和DHAV-3的單重RT-PCR方法，并對(duì)引物特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。在單重RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)DHAV-1和DHAV-3共感染的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。特異性檢測(cè)結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)，只針對(duì)DHAV-1

7、和DHAV-3進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而對(duì)禽流感病毒(H9N2)、新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨疫李默氏桿菌和大腸桿菌等其他鴨常見(jiàn)病原微生物均無(wú)擴(kuò)增。敏感性檢測(cè)結(jié)果表明該方法靈敏度高，最低可檢測(cè)到10 pg的鴨肝組織總RNA和102個(gè)拷貝的病毒RNA。應(yīng)用該方法對(duì)從山東，河南，四川，廣東四個(gè)省26個(gè)鴨場(chǎng)的60份疑似鴨病毒性肝炎的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中檢測(cè)到DHAV-1和DHAV-3的混合感染23(38.3％)例，DHAV-1的單純感染11

8、(18.3％)例，DHAV-3的單純感染18(30％)例，陰性樣本8(13.3％)例。
　　 3、鴨甲肝病毒1型、3型和鴨星狀病毒1型的多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1的基因組序列，選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)合成了3對(duì)引物。應(yīng)用這3對(duì)引物，分別建立了檢測(cè)DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1的單重RT-PCR方法，并對(duì)其特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。在單重PC

9、R的基礎(chǔ)上建立了同時(shí)檢測(cè)這三種病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法。特異性檢測(cè)結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)，只針對(duì)DHAV-1、DHAV-3和DAstV-1進(jìn)行特異性擴(kuò)增，而對(duì)禽流感病毒(H9N2)、新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌等其他鴨常見(jiàn)病原微生物均無(wú)擴(kuò)增。靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明該方法靈敏度高，最低可檢測(cè)10 pg的鴨肝組織總RNA和102個(gè)拷貝的病毒RNA。該方法首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)我國(guó)目前流行的所有亞型的DHV同時(shí)進(jìn)行快速鑒