膀胱起搏細(xì)胞初探：成年豚鼠膀胱ICC樣細(xì)胞的形態(tài)鑒定和電流特性研究.pdf

1、生理?xiàng)l件下，在體膀胱可記錄到起源于膀胱頂，向膀胱頸方向傳播的自發(fā)性、規(guī)律性慢波，推測(cè)在膀胱頂存在有起搏細(xì)胞；逼尿肌不穩(wěn)定表現(xiàn)為病理狀態(tài)下的全膀胱或大部分膀胱組織協(xié)調(diào)收縮，提示膀胱存在有一個(gè)興奮性最高的控制點(diǎn)(即起搏點(diǎn))。而離體的膀胱平滑肌肌條在完全阻斷了神經(jīng)影響(切斷神經(jīng)支配以及加入神經(jīng)阻滯劑)的情況下，仍然存在有節(jié)律的自發(fā)性收縮。該現(xiàn)象表明離體膀胱平滑肌的收縮不依賴(lài)于神經(jīng)因素而與膀胱平滑肌本身特性有關(guān)，是一種由起搏細(xì)胞控制的肌源性的自

2、發(fā)興奮、收縮。理論上存在的膀胱起搏細(xì)胞目前仍是未解之迷，尚未見(jiàn)明確說(shuō)法。 卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞(interstitialcellsofCajal，ICC)在胃腸道的起搏作用和膀胱逼尿肌與胃腸道平滑肌相似的生理特性，為我們探求膀胱起搏細(xì)胞提供了一個(gè)理想的切入點(diǎn)。采用ICC特異鑒定方法——KIT免疫組織化學(xué)染色，KIT陽(yáng)性、形態(tài)與胃腸道ICC相似的ICC樣細(xì)胞被證實(shí)存在于豚鼠和人的膀胱，且推測(cè)其可能就是膀胱的起搏細(xì)胞。但目前相關(guān)研究報(bào)道較

3、少，且集中于形態(tài)學(xué)研究，尚沒(méi)有ICC樣細(xì)胞就是膀胱起博細(xì)胞的證據(jù)。本課題以成年豚鼠為研究對(duì)象，在證實(shí)ICC樣細(xì)胞存在于豚鼠膀胱的基礎(chǔ)上，采用酶消化法，體外得到培養(yǎng)狀態(tài)下的ICC樣細(xì)胞，利用膜片鉗技術(shù)，在全細(xì)胞記錄模式下觀察其是否具有起博細(xì)胞的電流特性，以證明其是否為膀胱的起博細(xì)胞。本研究結(jié)果將豐富膀胱神經(jīng)生理理論，對(duì)于理解與排尿有關(guān)的生理和病理生理機(jī)制都會(huì)增加全新的認(rèn)識(shí)，并為臨床上治療某些疾病(如DI)提供新的靶點(diǎn)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)

4、果及結(jié)論如下： 1.建立了能有效觀察膀胱ICC樣細(xì)胞的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法：采用改良的國(guó)外學(xué)者制備膀胱鋪片方法，通過(guò)KIT免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，證實(shí)在成年豚鼠膀胱的粘膜下層和逼尿肌肌束邊緣存在有ICC樣細(xì)胞。 2.建立了膀胱ICC樣細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法：采用酶消化法得到原代培養(yǎng)狀態(tài)下的膀胱ICC樣細(xì)胞和逼尿肌細(xì)胞；采用liberase膠原酶較傳統(tǒng)膠原酶可明顯縮短成年豚鼠膀胱ICC樣細(xì)胞和逼尿肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的組織消化時(shí)間。

5、 3.體外培養(yǎng)狀態(tài)下，ICC樣細(xì)胞和逼尿肌細(xì)胞存在明顯差別：(1)形態(tài)差別：ICC樣細(xì)胞在培養(yǎng)狀態(tài)下的形態(tài)和組織切片相似，胞體均為梭形，胞體兩極有兩個(gè)細(xì)胞突起；逼尿肌培養(yǎng)狀態(tài)下呈成纖維樣生長(zhǎng)，細(xì)胞突起不規(guī)則。用免疫組織化學(xué)方法，可鑒定和區(qū)別這兩類(lèi)細(xì)胞：ICC樣細(xì)胞KIT染色陽(yáng)性，α-SM-Actin染色陰性；逼尿肌細(xì)胞KIT染色陰性，α-SM-Actin染色陽(yáng)性。(2)增殖情況差別：成年豚鼠膀胱ICC樣細(xì)胞在原代培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞數(shù)

6、目無(wú)明顯增加；相同培養(yǎng)條件下的逼尿肌細(xì)胞增殖速度明顯快于ICC樣細(xì)胞，約7天以后即可傳代。 4.建立了簡(jiǎn)單、有效的ICC樣細(xì)胞純化方法：由于逼尿肌細(xì)胞屬于平滑肌細(xì)胞，貼壁能力相對(duì)弱于其它類(lèi)型的細(xì)胞(接種后24小時(shí))；而ICC樣細(xì)胞貼壁能力明顯強(qiáng)于逼尿肌細(xì)胞(接種后3小時(shí)即可貼壁)。利用培養(yǎng)初期兩種細(xì)胞貼壁能力的差異，在混合培養(yǎng)中，ICC樣細(xì)胞貼壁后將尚未貼壁、漂浮的平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)初期即可分離兩種細(xì)胞，分別得

7、到相對(duì)純化的ICC樣細(xì)胞和逼尿肌細(xì)胞。與免疫磁珠分選法相比，實(shí)驗(yàn)步驟更為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)。 5.膜片鉗技術(shù)能夠精確直觀地對(duì)細(xì)胞膜離子通道活動(dòng)進(jìn)行分析，直接得到有關(guān)細(xì)胞跨膜電位及電流變化信息。采用膜片鉗技術(shù)，在全細(xì)胞記錄模式下，首次記錄到成年豚鼠膀胱ICC樣細(xì)胞具有起搏細(xì)胞的特征電流Ih，提示ICC樣細(xì)胞在膀胱可能起著起搏作用。Ih特異性阻斷劑ZD7288對(duì)ICC樣細(xì)胞Ih有明顯抑制作用，并呈劑量依賴(lài)性。在相同記錄模式下，逼尿肌細(xì)胞記錄