脂肪干細(xì)胞復(fù)合膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)促進(jìn)膀胱再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，膀胱重建仍然是泌尿外科的難題之一，臨床對(duì)于膀胱重建多采用腸道作為重建材料，但存在著取材部位并發(fā)癥，創(chuàng)傷大，術(shù)后電解質(zhì)紊亂，結(jié)石，輸尿管返流，粘液引起梗阻等一系列并發(fā)癥。隨著組織工程的出現(xiàn)和快速發(fā)展，為膀胱重建提供了新的方法。本研究探討了應(yīng)用脂肪干細(xì)胞復(fù)合BAMG組織重建膀胱的可行性，以期為膀胱的修復(fù)重建手術(shù)提供新的選擇。全文共分四章：
　　 第一章種子細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 1.目的：
　　 探討兔脂肪干細(xì)胞分離

2、，體外培養(yǎng)增殖及鑒定方法。
　　 2.材料和方法：
　　 應(yīng)用膠原酶消化法分離培養(yǎng)兔脂肪干細(xì)胞，獲得脂肪干細(xì)胞后運(yùn)用MTT分析細(xì)胞生長特性。利用免疫熒光對(duì)脂肪干細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行鑒定。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志(CD29，CD31，CD34，CD44，CD45，CD90，CD105，CD106和CD166)。
　　 3.結(jié)果：
　　 原代培養(yǎng)3d后可見ADSCs貼壁生長，約7天左右可傳代培養(yǎng)。鏡下觀察AD

3、SCs貼壁后絕大多數(shù)為紡錘形，少數(shù)有突起，為不規(guī)則狀，細(xì)胞相互之間以細(xì)絲拉網(wǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞MTT顯示細(xì)胞指數(shù)增長期為6天左右，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。免疫熒光檢測(cè)示α-actin陽性，Vimentin及HLA-DR均為陰性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果CD31、CD90、CD44、CD105、CD166、CD29的表達(dá)均成陽性，CD106、CD34、CD45表達(dá)為陰性。
　　 4.結(jié)論：
　　 目前利用膠原酶消化法可獲得純度較高的脂肪干細(xì)胞，

4、來源廣泛，獲取簡單，并且創(chuàng)傷小。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可以保持在穩(wěn)定的群體倍增數(shù)增長階段并且細(xì)胞衰老率達(dá)到最低。脂肪干細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，因此很難從形態(tài)上來區(qū)分兩者。在研究中，我們采用了流失細(xì)胞對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，結(jié)果意味著脂肪干細(xì)胞由未分化的干細(xì)胞，造血系細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞組成的細(xì)胞群，是良好的組織工程種子細(xì)胞來源。
　　 第二章膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(BAMG)的制備及其理化性質(zhì)的評(píng)估
　　 1.目的

5、：
　　 探討經(jīng)改良后的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(BAMG)的理化性質(zhì)及生物相容性。
　　 2.方法：
　　 以1％的Triton-X100與0.1％NH3H20脫細(xì)胞法制備膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(BAMG)，一種常規(guī)酒精浸泡處理，另一種經(jīng)冷凍抽干處理，改善其理化性質(zhì)。兩種BAMG分別通過蘇木精-伊紅染色、Masson染色、掃描電鏡及力學(xué)測(cè)定研究其理化性質(zhì)；單軸拉伸測(cè)試測(cè)定其生物力學(xué)特性，光鏡及掃描電鏡法測(cè)定支架表面孔徑大小，采用

6、兔膀胱平滑肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞，通過細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞活力測(cè)定(MTT法)、皮下埋植實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)2種不同處理的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的各種生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)比較。
　　 3.結(jié)果：
　　 蘇木精-伊紅染色及Mason染色顯示2種膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)無細(xì)胞成分殘留，保持較完整的膠原成分；電鏡掃描表面均呈裂隙狀結(jié)構(gòu)，以膠原為主，適合細(xì)胞黏附；力學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)保持了原來膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的力學(xué)特征，且具有更好的拉伸率；MTT法測(cè)定細(xì)胞

7、毒性均為0級(jí)；與膀胱平滑肌細(xì)胞均有良好的黏附性；兔皮下埋植1個(gè)月，均與皮下組織黏附良好，有肌肉黏附及血管增生
　　 4.結(jié)論：
　　 經(jīng)凍干后真空抽干的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好可操作性及拉伸率，且保持了原有的生物相容性，制作簡單，并更有利于術(shù)中操作，是理想的組織工程生物支架。
　　 第三章單純膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)重建不同面積的膀胱的實(shí)驗(yàn)研究
　　 1.目的：
　　 探討單純的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(BAMG)重建

8、不同面積膀胱缺損的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.方法：
　　 將制備的BAMG分別修補(bǔ)兔的不同面積的膀胱缺損(A組30-40％膀胱缺損；B組50-60％膀胱缺損)。術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行膀胱造影、大體觀察和組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)膀胱重建情況。
　　 3.結(jié)果：
　　 兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中共2只動(dòng)物于術(shù)后第三天和第四天死亡。術(shù)后24周后，大體觀察兩組均見修補(bǔ)區(qū)被肉芽組織覆蓋，與周圍組織無明顯區(qū)別。測(cè)量膀胱容量，A組為術(shù)前

9、膀胱容量的94.39％±0.54％，并且通過組織學(xué)檢測(cè)可見正常的膀胱上皮和膀胱平滑肌組織。B組的膀胱容量為術(shù)前的64.5％±3.19％，組織學(xué)檢測(cè)可見修補(bǔ)區(qū)有復(fù)層的膀胱上皮再生，但無排列有序的膀胱平滑肌組織，無正常的膀胱壁組織。
　　 4.結(jié)論：
　　 BAMG作為生物支架，能夠作為膀胱重建的材料，但只能修補(bǔ)較小的膀胱缺損。對(duì)于較大面積的膀胱缺損，無法形成正常的完整的膀胱壁組織。
　　 第四章脂肪干細(xì)胞復(fù)合膀胱脫

10、細(xì)胞基質(zhì)促進(jìn)膀胱再生的實(shí)驗(yàn)研究
　　 1.目的：
　　 探討脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived Stem Cell ADSCc)在兔的組織工程膀胱重建中的應(yīng)用。
　　 2.方法：
　　 分別采用單純的BAMG及復(fù)合脂肪干細(xì)胞的BAMG對(duì)雄性新西蘭兔行膀胱50％-60％部分切除術(shù)進(jìn)行替代修補(bǔ)，每組4、8、12，24周后進(jìn)行膀胱造影并組織學(xué)檢測(cè)。
　　 3.結(jié)果：
　　 經(jīng)過GFP標(biāo)記

11、的ADSCs種植于BAMG表面生長良好，于1周后細(xì)胞增殖至項(xiàng)峰。分別用兩種修補(bǔ)材料進(jìn)行膀胱缺損修補(bǔ)24周后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組膀胱容積分別為術(shù)前的69.33±5.05％和94.68±3.31％，具有正常膀胱形態(tài)。組織染色分析A組顯示上皮層正常，粘膜下纖維組織增生而肌層較薄；B組則顯示了與自體膀胱相似的正常的3層組織結(jié)構(gòu)。
　　 4.結(jié)論：
　　 ADSCs擴(kuò)增后在BAMG上生長良好。單純應(yīng)用BAMG膀胱容積不能夠完全恢復(fù)正常