豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)生物學(xué)特性及犬體內(nèi)膀胱替代修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究工作分為三部分： 第一部分：豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)生物支架材料的制備及其相關(guān)生物學(xué)特性研究。 目的：通過檢測豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)(PBAM)的物理和生物學(xué)特性及其有關(guān)組成成分的含量，探討PBAM作為膀胱替代生物支架材料或組織工程用支架材料的可行性。 方法：采用低滲-去污劑洗滌-核酸酶消化脫細(xì)胞方法去除豬膀胱中的細(xì)胞成分，制備成膀胱無細(xì)胞基質(zhì)，通過H-E染色及Massons染色光鏡檢查觀察去細(xì)胞效果；分子生物學(xué)方法測定

2、PBAM中DNA含量；采用ELISA方法測定PBAM中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的含量；應(yīng)用萬能電子拉伸機(jī)進(jìn)行PBAM生物力學(xué)測定。 結(jié)果：經(jīng)脫細(xì)胞處理后，光鏡觀察無細(xì)胞殘留，基質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整，但PBAM中DNA的含量僅減少至2％～5％，后經(jīng)進(jìn)一步重復(fù)雙核酸酶消化及加強(qiáng)換液次數(shù)后，DNA的含量均低于1％。PBAM中仍含有一定量的生長因子TGF-β1；生物力學(xué)性能基本穩(wěn)定，仍有一定的彈性和韌度。 結(jié)論：

3、1、所制備的PBAM物理性狀及生物力學(xué)性能穩(wěn)定。 2、國內(nèi)外首次采用ELISA方法檢測到PBAM中仍含有一定量的生長因子TGF-β1，表明其在組織工程膀胱的構(gòu)建中具有潛在的積極作用。 3、所制備的PBAM具有無菌、無毒和良好的組織相容性，能長期儲存，可以作為“現(xiàn)成品”用于組織工程、器官替代及修補(bǔ)用生物支架材料的應(yīng)用研究。 第二部分：豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)在異種移植中的免疫原性及生物安全性研究。 目的：進(jìn)一步對所

4、制備的豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)移植物進(jìn)行免疫原性及生物安全性檢測。 方法：通過采用免疫組化方法檢測此去細(xì)胞過程對豬膀胱中結(jié)構(gòu)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ(Major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)抗原和α-半乳糖基抗原(α-galactosyl resi dLles，α-Gal)表達(dá)情況的影響；通過分子生物學(xué)方法觀察此去細(xì)胞過程對豬膀胱中的PERV的影響，以及把PBAM作為支架材料進(jìn)行

5、犬膀胱替代修復(fù)實(shí)驗(yàn)，觀察異種移植前后PERV的表達(dá)情況。 結(jié)果：新鮮豬膀胱有豬α-Gal和MHC-Ⅰ抗原的高表達(dá)，經(jīng)脫細(xì)胞處理后，PBAM中α-Gal和MHC-Ⅰ抗原的活性表達(dá)均明顯降低或基本無表達(dá)；新鮮豬膀胱基因組內(nèi)存在PERV基因序列，經(jīng)去細(xì)胞處理所制備的PBAM未發(fā)現(xiàn)有PERV基因序列。應(yīng)用PBAM進(jìn)行異種移植或者說作為支架材料進(jìn)行異種膀胱替代沒有發(fā)現(xiàn)活性PERV傳染的證據(jù)。 結(jié)論： 1、新鮮豬膀胱存在有與

6、異種移植免疫排斥反應(yīng)直接有關(guān)的主要抗原α-Gal和MHC-Ⅰ，PBAM中α-Gal和MHC-Ⅰ抗原的活性表達(dá)均明顯降低或基本無表達(dá)。 2、新鮮豬膀胱基因組內(nèi)存在PERV基因序列，PBAM中無PERV基因序列。 3、應(yīng)用PBAM進(jìn)行異種移植或作為支架材料制備組織工程膀胱進(jìn)行異種膀胱替代可能具有良好的免疫耐受性及可靠的生物安全性。 第三部分：豬膀胱無細(xì)胞基質(zhì)在異種動物犬體內(nèi)進(jìn)行膀胱修補(bǔ)替代性實(shí)驗(yàn)研究。 目的：

7、觀察PBAM在異種動物體內(nèi)的生物相容性、生物降解情況及生物安全性問題，同時(shí)觀察單純應(yīng)用PBAM進(jìn)行膀胱替代修補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是否可行，修補(bǔ)面積大小對膀胱再生是否有影響，為下一步構(gòu)建組織工程膀胱及尿路組織缺損的修復(fù)和替代提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：雜種犬分四組，A組為對照組，切除50％膀胱后原位直接縫合，B組、C組和D組為實(shí)驗(yàn)組，分別切除50％膀胱后用用PBAM替代修補(bǔ)(修補(bǔ)面積約為原膀胱的30％、40％、50％，PBAM大小分別約為16cm<'

8、2>、30cm<'2>、64cm<'2>)。術(shù)前及術(shù)后查血常規(guī)、電解質(zhì)及血肌酐情況。術(shù)前及PBAM移植后1個(gè)月檢測PERV。術(shù)前及術(shù)后12周行膀胱測壓及膀胱順應(yīng)性的檢查，并行腹部平片及膀胱造影檢查。術(shù)后12周及24周每組分別處死一條犬進(jìn)行大體標(biāo)本及病理學(xué)檢查。 結(jié)果：有8條犬安全度過圍手術(shù)期，術(shù)后血常規(guī)及腎功能檢查對照組與實(shí)驗(yàn)組無差別；其中D組兩條犬分別在術(shù)后28天和34天時(shí)死亡，尸體解剖死亡原因均為修補(bǔ)中心處膀胱穿孔、漏尿、腹

9、腔內(nèi)感染所致。術(shù)后12周時(shí)，A組、B組和C組膀胱容量分別恢復(fù)到術(shù)前63％，85％，89％，膀胱順應(yīng)性分別恢復(fù)到原來的67％，88％，87％。腹平片均未見有明顯膀胱結(jié)石形成；12周時(shí)的膀胱標(biāo)本很難找到支架與膀胱吻合處，支架明顯萎縮，面積減小至75-85％，已經(jīng)被新生的膀胱組織取代，但壁較薄，已修復(fù)如正常的膀胱外觀。組織學(xué)檢查顯示基質(zhì)支架替代部分膀胱區(qū)域基本形成多層移行上皮細(xì)胞，與正常的泌尿上皮細(xì)胞差異不大，有少量白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，可見

10、散在平滑肌肌束。24周的標(biāo)本，已經(jīng)找不到支架，支架已經(jīng)被完全吸收，支架內(nèi)表面光滑，有肉眼可見的血管網(wǎng)，外表面觸之較粗糙。組織學(xué)檢查顯示膀胱各層組織基本完全再生，基本完成膀胱組織替代重建。對照組的標(biāo)本觀察符合切口愈合過程。在12周時(shí)分別處死的B組和C組1條犬的膀胱標(biāo)本修補(bǔ)處膀胱發(fā)現(xiàn)有泥沙樣顆粒附著，24周時(shí)所有膀胱標(biāo)本均未見有結(jié)石形成。 結(jié)論： 1、PBAM作為生物支架材料生物相容性良好，支架材料可完全吸收，并可基本完成膀