鴨源巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及其免疫應(yīng)答反應(yīng)的動(dòng)態(tài)研究.pdf

1、本研究選用從四川某養(yǎng)殖場(chǎng)分離的兩株鴨金黃色葡萄球菌DS12、DS13和三株鴨多殺性巴氏桿菌D22、D23和D157為制苗菌株，采用固體表面培養(yǎng)法，以蜂膠為免疫佐劑，制備鴨巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌二聯(lián)蜂膠滅活疫苗。該疫苗物理性狀符合疫苗制作的基本要求，經(jīng)安全性檢驗(yàn)證明其安全可靠；通過篩選確定了該疫苗的最佳免疫劑量為5×109CFU/mL，0.5ml/只，4℃可保存12個(gè)月以上。 本研究建立了檢測(cè)鴨金黃色葡萄球菌抗體和鴨巴氏桿菌抗體

2、的間接ELISA方法，對(duì)制備的鴨巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌(P.multocide-S.aureus)二聯(lián)蜂膠滅活疫苗的體液免疫應(yīng)答進(jìn)行研究。采用鴨巴氏桿菌、葡萄球菌全菌裂解抗原為包被抗原，建立檢測(cè)P.multocide-S.aureus二聯(lián)蜂膠滅活疫苗免疫后的鴨血清中特異性抗體的ELISA方法。確定了金黃色葡萄球菌抗原最佳包被濃度：DS12最佳包被濃度為5.5μg/mL，DS13最佳包被濃度為6.25μg/mL；巴氏桿菌抗原最佳包被濃度

3、：D22最佳包被濃度為11μg/mL，D23最佳包被濃度為17μg/mL，D157最佳包被濃度為16μg/mL。酶標(biāo)羊抗鴨IgG的最佳濃度為0.125μg/mL。經(jīng)交叉試驗(yàn)，重復(fù)性試驗(yàn)證實(shí)建立的ELISA重復(fù)性好、特異性強(qiáng)。板內(nèi)變異系數(shù)分別為1.71％-4.06％(金黃色葡萄球菌)、1.93％-3.55％(巴氏桿菌)，板間變異系數(shù)分別為1.82％-4.18％(金黃色葡萄球菌)、1.96％-4.75％(巴氏桿菌)。包被金黃色葡萄球菌抗原建

4、立的間接ELISA方法的靈敏度是微量凝集試驗(yàn)的50-100倍，包被巴氏桿菌抗原建立的間接ELISA方法的靈敏度是微量凝集試驗(yàn)的50-100倍。 應(yīng)用建立的ELISA方法對(duì)該疫苗的體液免疫應(yīng)答進(jìn)行研究。結(jié)果表明，注射了P.multocide-S.aureus二聯(lián)蜂膠滅活疫苗后，試驗(yàn)鴨在第3d開始產(chǎn)生免疫力，P.multocide和S.aureus共5株菌的抗體水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，并在免疫后26d左右達(dá)到抗體最高水平，然后逐

5、漸下降，免疫后75d的抗體水平與免疫后兩周的抗體水平相當(dāng)。且在免疫后的3-75d，一次免疫組的特異性抗體水平極顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P＜0.01)，二次免疫組的特異性抗體水平于一次免疫后9d開始顯著高于一次免疫組(P＜0.05)，于12-75d極顯著高于一次免疫組(P＜0.01)。 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗對(duì)巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌同源菌株的攻擊有保護(hù)力，一次免疫后14d，對(duì)巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的保護(hù)率分別為90％和7

6、0％，二次免疫后14d，對(duì)巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的保護(hù)率分別為100％和80％。 采用MTT比色法對(duì)T淋巴轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，一次免疫組從免疫后的3d起，鴨外周血T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的反應(yīng)增強(qiáng)，明顯高于對(duì)照組，到第9d時(shí)達(dá)到峰值，然后迅速下降。二次免疫組于免疫后第9-12d時(shí)，鴨外周血T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的反應(yīng)較強(qiáng)，且與一次免疫組差異極顯著(P＜0.01)，第19d時(shí)，二次免疫組和一次免疫組差異顯著(P＜0.05)