人骨髓細(xì)胞和脫細(xì)胞牛頸靜脈構(gòu)建組織工程血管的初步研究.pdf

1、全文分為二章: 第一章制備帶瓣牛頸靜脈脫細(xì)胞基質(zhì)的研究 目的：探討比較理想的制備帶瓣牛頸靜脈血管脫細(xì)胞基質(zhì)的方法。 方法：將60個(gè)新鮮的帶瓣牛頸靜脈血管片分成新鮮對(duì)照組和不同脫細(xì)胞方法處理組等共10組(n=6)。觀察不同脫細(xì)胞方法處理后的牛頸靜脈血管片的大體形態(tài)、脫細(xì)胞的完整程度、膠原彈力纖維保存的完整性、熱皺縮溫度的變化和最大抗張強(qiáng)度下降的程度。 結(jié)果：所有脫細(xì)胞處理后的各組牛頸靜脈血管片中除了Ⅲ組的瓣

2、膜結(jié)構(gòu)有破壞外，其他組的血管壁和瓣膜結(jié)構(gòu)完好，和新鮮組相似；各組的熱皺縮溫度和新鮮對(duì)照組比較無顯著性差異。過高濃度的胰蛋白酶(0.125％)或過長(zhǎng)的胰蛋白酶消化時(shí)間(24h)可破壞瓣膜結(jié)構(gòu)和牛頸靜脈血管中膠原彈力纖維，使得最大抗張強(qiáng)度比新鮮對(duì)照組下降20％以上；單純的曲那通X-100(0.25％)加低濃度的胰蛋白酶(0.025％)脫細(xì)胞處理的牛頸靜脈血管片殘留部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)；溫和的多步驟去垢劑-酶消化法(0.25％或0.5％曲那通X-10

3、0，0.025％或0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，20u/mlDNase-Ⅰ和0.2mg/mlRNase-A)脫細(xì)胞處理后的帶瓣牛頸靜脈血管片比較理想：血管壁和瓣膜大體形態(tài)和處理前相似，光鏡和電鏡觀察顯示細(xì)胞成分去除完全，膠原彈力纖維保存完整，最大抗張強(qiáng)度比新鮮對(duì)照組下降約10％～14％。 結(jié)論：多步驟去垢劑-酶消化法(0.25％或0.5％曲那通X-10048h,0.025％或0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA30m

4、in，20u/mlDNase-Ⅰ和0.2mg/mlRNase-A24h)脫細(xì)胞處理后的帶瓣牛頸靜脈脫細(xì)胞基質(zhì)是比較理想的組織工程血管支架。 第二章人骨髓細(xì)胞和脫細(xì)胞牛頸靜脈體外構(gòu)建組織工程血管片的研究 目的：研究從人骨髓細(xì)胞中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞，將它們?cè)隗w外培養(yǎng)分化為平滑肌樣細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并種植到牛頸靜脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料上培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程血管片。 方法：1.使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，通

5、過密度梯度離心法從人骨髓細(xì)胞中分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用貼壁培養(yǎng)法獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，CD44抗原染色鑒定；體外培養(yǎng)自然分化為平滑肌樣細(xì)胞，通過a～平滑肌肌動(dòng)蛋白染色鑒定。 2.骨髓單個(gè)核細(xì)胞通過反復(fù)貼壁培養(yǎng)法獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞，CD34抗原染色鑒定；用含多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株條件培養(yǎng)液的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，CD31和人類Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定。 3.將預(yù)處理好的牛頸靜脈脫細(xì)胞基

6、質(zhì)材料分為A、B、C共3組，分別將平滑肌樣細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)或依次種植到牛頸靜脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料上，體外靜態(tài)培養(yǎng)14天后，掃描和透射電鏡檢測(cè)血管片上細(xì)胞的生長(zhǎng)情況、血管腔面的細(xì)胞覆蓋率以及血管壁中層是否有細(xì)胞長(zhǎng)入。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈螺旋狀、放射狀生長(zhǎng)排列，其細(xì)胞CD44抗原表達(dá)的陽性率約80％，第4代細(xì)胞中a～平滑肌動(dòng)蛋白抗原表達(dá)的陽性率約95％。原代培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞很快形成克隆，第2代細(xì)胞中CD34相關(guān)抗原

7、的表達(dá)陽性率約25％，從第4代細(xì)胞起表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈“鋪路石”狀，并表現(xiàn)接觸抑制的特點(diǎn)，第5代細(xì)胞CD34相關(guān)抗原表達(dá)陰性，CD31和第Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)的陽性率為50％左右；在整個(gè)培養(yǎng)過程中有成纖維細(xì)胞樣雜細(xì)胞存在。掃描電鏡檢測(cè)到各組血管片上均有較致密的細(xì)胞覆蓋生長(zhǎng)，但細(xì)胞排列無序，A、B、C三組血管片的細(xì)胞覆蓋率分別為70％，78％和83％，透射電鏡示血管壁中層無(A、B組)或僅有少量細(xì)胞長(zhǎng)入(C組)。 結(jié)論：1.骨