轉基因骨髓間充質干細胞和脫細胞基質構建椎間盤組織工程纖維環(huán)的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　自新西蘭大白兔股骨穿刺抽取兔骨髓液，貼壁法分離培養(yǎng)出兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)，用流式細胞儀對兔BMSCs表面的陽性標記物和陰性標記物進行檢測予以確定所得種子細胞為目標細胞;并對目標種子細胞的分化能力進行成骨、成軟骨及成脂能力進行檢測，以確定目標種子細胞的增殖分化能力。構建TGF-β1、Sox-9基因序列并鑒定其正確性，以pLVX-IRES-Puro為穿梭載體，構建TGF-β1(pLVX-TGF-β1)和So

2、x-9(pLVX-Sox-9)載體，以確定轉染的可行性。聯(lián)合TGF-β1、Sox-9共轉染兔BMSCs，進行目的基因與下游基因的檢測，以確定轉染后新型干細胞作為種子細胞的可行性與優(yōu)勢。以Courtman脫細胞法對豬纖維環(huán)進行脫細胞處理得到脫細胞纖維環(huán)支架，并進行脫細胞效果檢測，行脫細胞支架與共轉染干細胞復合構建組織工程纖維環(huán)的實驗研究。
　　研究方法:
　　骨穿獲取兔骨髓液后行貼壁培養(yǎng)后分離培養(yǎng)出兔BMSCs，利用流式細胞術

3、對細胞表面標記物CD29、CD31、CD44、CD45、CD90進行檢測以確定其為本研究所需要的目標種子細胞。人工合成Sox-9、TGF-β1基因片段，并行其基因序列檢測確定其正確性。
　　以全骨髓貼壁法對獲取的新西蘭大白兔骨髓進行細胞培養(yǎng)處理，分離出兔BMSCs，通過兔BMSCs表面抗原檢測來鑒定所分離培養(yǎng)的BMSCs的真實可靠性。人工合成Sox-9和TGF-β1基因片段，通過基因測序的方法來確定構建的基因序列。以pLVX-IR

4、ES-Puro為穿梭載體，構建TGF-β1慢病毒(pLVX-TGF-β1)和(pLVX-Sox-9)，通過Real-time PCR對已構建的TGF-β1、Sox-9慢病毒進行檢測，根據TGF-β1、Sox-9mRNA的表達情況來初步推斷是否轉染成功。將已成功獲取并已鑒定的兔BMSCs傳代培養(yǎng)后，分為:A.空載體組;B.TGF-β1基因單獨轉染組;C.Sox-9基因單獨轉染組;D.TGF-β1和Sox-9基因共轉染組。四組培養(yǎng)條件相同，

5、37℃、CO2濃度5％的環(huán)境下用普通的高糖培養(yǎng)基HG-DMEM對細胞培養(yǎng)2w，以Real-Time PCR、Western-Blot方法對A、B、C、D四組的目的基因TGF-β1和Sox-9表達情況進行檢測。以Western-Blot法測定各組細胞下游產物的mRNA表達水平:ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅩ。用改良的Courtman法制備纖維環(huán)脫細胞支架，用HE、電鏡掃描、GAG含量檢測、DNA含量檢

6、測以及免疫源性等評估脫細胞纖維環(huán)支架，將纖維環(huán)脫細胞支架與TGF-β1和Sox-9共轉染的干細胞混合培養(yǎng)，利用鬼筆環(huán)肽、DAPI及共聚焦顯微鏡來檢測脫細胞纖維環(huán)支架及細胞在培養(yǎng)基中的生長情況。
　　研究結果：
　　課題組獲取分離培養(yǎng)獲取的兔BMSCs干細胞在經過不同的誘導條件處理后具有向成骨、成軟骨以及脂肪細胞多向分化的能力。對兔BMSCs行流式細胞術分析鑒定，確定了兔BMSCs表面CD31、CD45標記物的陰性表達，CD2

7、9、CD44、CD90等表面標記物的陽性表達。TGF-β1和Sox-9基因測序證明合成基因序列正確無誤。以pLVX-IRES-Puro為穿梭載體構建的TGF-β1和Sox-9慢病毒用PCR對DNA進行擴增，再行電泳對酶切片段檢測，結果顯示含有所構建的以慢病毒為載體TGF-β1、Sox-9片段。
　　以TGF-β1和Sox-9重組慢病毒共同轉染兔BMSCs，用普通的高糖培養(yǎng)基HG-DMEM孵育2w，細胞形態(tài)隨著時間推移發(fā)生顯著改變，

8、成明顯梭狀改變。Western-blot方法檢測Sox-9、TGF-β1蛋白表達增高顯著。培養(yǎng)2w時，Western-Blot檢測了下游產物的表達水平，ACAN和Sox-9在單獨轉染和共轉染組中表達沒有顯著差異，CollagenⅡ的表達在共轉染組中要顯著高于各單獨轉染組;ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、Sox-9基因的表達水平較對照組明顯上調。CollageⅩ基因的表達在Sox-9單獨轉染組和TGF-β1、Sox-9共

9、轉染組中都要明顯低于空載體組和TGF-β1單獨轉染組。以改良Courtman法制備纖維環(huán)脫細胞支架后，將TGF-β1、Sox-9基因共轉染的BMSCs與支架復合培養(yǎng)，細胞的增殖狀態(tài)以及下游Ⅱ型膠原的表達明顯高于普通BMSCs。轉基因兔BMSCs能夠均勻的分布于支架表面并生長良好。
　　研究結論:
　　全骨髓貼壁法在兔BMSCs分離培養(yǎng)的應用中具有顯著的可行性，成功獲取大量生長良好的兔BMSCs。以pLVX-IRES-Puro

10、為穿梭載體可以成功構建TGF-β1和Sox-9慢病毒，且其可成功共同轉染兔BMSCs，獲得TGF-β1和Sox-9雙基因蛋白的穩(wěn)定表達。對于TGF-β1和Sox-9慢病毒共轉染兔BMSCs后，下游基因CollagenⅩ膠原基因的表達呈降低趨勢，ACAN、CollagenⅡ基因表達均明顯升高，共轉染后的干細胞具有明顯的成軟骨能力，表明兔BMSCs向類纖維環(huán)細胞方向表達轉化。改良后的Courtman脫細胞法所制備的脫細胞纖維環(huán)支架能夠適合轉