骨髓間充質干細胞體外構建組織工程血管管道的研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質干細胞的培養(yǎng) 目的 探索和建立人骨髓間充質干細胞體外分離和培養(yǎng)的技術方法，鑒定其生物學特性，為進一步建立組織工程血管做準備。 方法 人骨髓標本來源于30歲左右男性健康志愿者。按骨髓穿刺的常規(guī)方法，抽取胸骨骨髓液5ml，肝素抗凝。DMEM培養(yǎng)液稀釋后，用人淋巴細胞分離液密度梯度離心法，分離出單個核細胞。用DMEM洗滌，加入DMEM培養(yǎng)液，并加入10﹪胎牛血清(FCS)。臺盼藍染色檢測細胞活

2、力。24小時后，吸取培養(yǎng)液，連同未貼壁細胞棄去。貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換半量的培養(yǎng)液，12天后細胞融合時，用0.25﹪胰蛋白酶/0.02﹪EDTA消化液消化后，細胞傳代，倒置顯微鏡每天觀察生長情況。繪制(P1、P5、P10)生長曲線，并計算原代和前兩代傳代干細胞的貼壁率。對第三代細胞行CD34的流式細胞儀表型鑒定。 結果 分離出人骨髓間充質干細胞經(jīng)臺盼藍染色證實95﹪以上為活細胞。經(jīng)過24小時的培養(yǎng)，原代細胞貼壁黏附

3、在培養(yǎng)瓶，換液棄未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，細胞呈克隆樣生長，12天后細胞融合。倒置相差顯微鏡觀察細胞貼壁生長，細胞呈梭形，排列有明顯的方向性。計算原代和前兩代間充質干細胞的貼壁率，貼壁率無明顯差異。消化傳代后細胞生長加速，約8-10天左右細胞即融合，可以消化傳代。培養(yǎng)到第四代時，細胞生長倍增穩(wěn)定。凍存細胞復蘇后，存活率達95﹪以上，增殖能力強，和傳代細胞具有相似的生長特性。對第1、5、10代細胞進行生長曲線的測定，結果顯示細胞傳代培養(yǎng)1-2

4、天細胞變化不大，細胞處于潛伏期。第三天起呈對數(shù)生長，至第5天到高峰，之后為平臺期。細胞表面CD34表達陰性。結論本實通過分離培養(yǎng)人間充質干細胞和研究其體外培養(yǎng)細胞的生物學特性，為組織工程學帶來新的細胞來源。 第二部分同種主動脈脫細胞血管基質的制備 目的 探討體外主動脈脫細胞的方法，為組織工程血管體的構建提供血管支架。 方法 取液氮保存的同種主動脈管道。將標本置于Tris低滲緩沖液(PH 8．0，0

5、．1﹪EDTA和抑肽酶10KIU/m;l)4℃下孵育14小時。用含0．1﹪SDS的Tris低滲緩沖液(PH8．0)37℃下再孵育24小時。轉入PBS溶液中清洗，37℃洗滌3次，每次20分鐘。用Tris等滲緩沖液(DNase200μg/ml，RNase200gμg/ml PH7．6)充分沖洗掉殘留細胞，完成脫細胞支架制備。并對脫細胞前后的管壁進行光鏡及電鏡形態(tài)學觀察以及進行理化性能測定。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，

6、兩樣本均數(shù)比較采用配對比較t檢驗，顯著性標準為P<0.05。 結果 人主動脈血管壁經(jīng)SDS法去細胞后，經(jīng)光鏡和電鏡觀察，脫細胞后血管壁無細胞殘留，膠原纖維和彈性纖維保留完整，脫細胞前后熱皺縮溫度無明顯變化(P>0.05)；去細胞后管壁含水量顯著增加，差別有顯著性(P<0.05)，去細胞前后管壁厚度無顯著性(P>0.05)(如表1)。 結論 SDS和消化酶法聯(lián)合去細胞效果良好，脫細胞前后理化性能沒有明顯變

7、化，初步制造了同種主動脈血管壁脫細胞基質材料，為構建同種血管管道提供了較合適的支架材料。 第三部分骨髓間充質干細胞在血管支架上的種植 目的 研究人骨髓間充質干細胞在脫細胞血管支架上種植的前景。 方法 提取人骨髓間充質干細胞經(jīng)過密度梯度法分離、培養(yǎng)和傳代。用SDS和DNase，RNase方法聯(lián)合脫去動脈壁的細胞，制成血管支架。將培養(yǎng)的人骨髓間充質干細胞種植在支架上。首先將支架用DMEM浸泡24小時，

8、用胎牛血清浸泡12小時，在支架上涂上一層粘連蛋白以增加支架的黏附性。然后再將培養(yǎng)的細胞按一定的濃度分兩次種植在支架上，培養(yǎng)7天。在光鏡和電鏡下觀察培養(yǎng)結果。 結果 標本表面有一層連續(xù)的細胞黏附生長，連續(xù)性較好，但是未向血管基質內部生長，作為種子細胞的人骨髓間充質干細胞在脫細胞基質上具有鋪展和生長能力。骨髓間充質干細胞與脫細胞血管基質支架居有良好的相容性，細胞在支架表面黏附緊密。 結論 骨髓間充質干細胞種植